Effekt av adenovirus E1A onkogen på DNA-replikationsdynamik

BAKGRUND:

TDet 243 aminosyrliga E1A-proteinet (även känt som litet E1A-protein, transformerande E1A-protein) som kodas av den vänstra änden av humant adenovirus (Ad) typ 2- eller 5-genom har studerats i olika sammanhang, inklusive som en modell som samarbetar onkoprotein, en apoptos inducerande protein och som ett terapeutiskt onkolytiskt protein. Alla dessa egenskaper är förknippade med dess förmåga att snabbt inducera S-fas i en mängd olika celler. E1A orkestrerar de flesta av dessa effekter genom att interagera med en rad kromatinremodelleringskomplex, inklusive Rb-familjens proteiner och HAT-proteinerna p300 och CBP.

Induktionen av E2F genom E1A-Rb-HDAC-interaktioner är väl dokumenterad medan konsekvenserna av E1A-p300/CBP-interaktioner i cellcykelprogression inte är tydliga. Tidigare studier har visat att p300/CBP förhindrar för tidigt inträde av vilande celler i S-fasen genom att undertrycka c-Myc-transkription genom ett tredelat repressorkomplex bestående av p300, YY1, HDAC3. E1A binder till p300 och dissocierar repressorkomplexet för att inducera S-fas. Induktion av c-Myc genom denna mekanism bidrar till induktionen av DNA-skadesvar och avvikande cellulär DNA-replikation som leder till genomisk instabilitet. I en nyligen publicerad studie visades det att E1A inducerar den pivotala DNA-replikationsinitieringsfaktorn Cdt1 till höga nivåer, vilket resulterar i ökad replikationsursprungsaktivitet och i sen S-fas, induktion av DNA-skadesvar och cellulär DNA-replikation. Genom att använda en molekyl DNA-fiberanalysen upptäcktes det att E1A inducerar betydande förändringar i dynamiken för DNA-replikation och verkar inducera globala förändringar i ursprungsaktivering.

Cdt1 är en pivotal DNA-replikationsinitieringsfaktor vars nivåer oscillerar under cellcykelprogression. I slutet av G1 stiger dess nivåer för att initiera DNA-replikation. I början av S-fasen bryts det omedelbart ned av E3-ligaset så att ursprung som redan avfyrats en gång inte avfyras igen i S-fasen och re-replikation inom en enskild cellcykel inte inträffar. Försämrad nedbrytning av Cdt1 i S-fas av E3-ligaset är den huvudsakliga mekanismen genom vilken det cellulära DNA:t genomgår re-replikation. Det upptäcktes att i E1A-uttryckande celler förblir Cdt1-nivåerna höga i S-fasen, vilket tyder på en ineffektiv nedbrytning av Cdt1 som kan bidra till omfattande re-replikation av cellulärt DNA som forskarna observerade i sen S-fas.

Myst-familjens protein HBO1 (Myst2, KAT7) är ett histonacetyltransferas som spelar en viktig roll vid replikationsinitiering och som också bidrar till DNA-re-replikation. HBO1 interagerar direkt med Cdt1 och fungerar som en samaktivator av Cdt1 vid replikationsinitiering. Det associeras också med replikationsursprung och stimulerar startaktivering genom att acetylera H4 K5, K8 och K12. Överuttryck av HBO1 inducerar DNA-re-replikation. Anrikningen av kromatinmodifieringar inklusive acetylering av H4-histoner vid ursprunget påverkar starkt ursprungsaktiveringen. Således tvingar E1A i frånvaro av en mängd serumstimulerade proliferationssignaler celler att gå in i S-fas med hjälp av flera kompensatoriska mekanismer. Okontrollerat cellulärt DNA-replikationsprogram orsakar polyploidi som är kännetecknet för cancer. Det är spännande att en viral onkogen som E1A förändrar det cellulära DNA-replikationsprogrammet. Detta väcker ett antal viktiga frågor relaterade till mekanismen för replikationsstress inducerad av en viral onkogen. Till exempel, hur inducerar E1A DNA-re-replikation? Ändrar E1A-stimulering av HBO1 initieringsmekanismen och huruvida HBO1-medierade kromatinmodifieringar vid ursprunget främjar re-replikation?

SÄRSKILT MÅL MED STUDIEN:

Vårt specifika mål är att avgöra om stimuleringen av HBO1-aktivitet av E1A spelar en roll i avreglerad DNA-replikation eller inte, och om den gör det, att bestämma mekanismen.

1. Med hjälp av standardanalyser kommer utredarna att avgöra om E1A binder till HBO1 för att inducera dess HAT-aktivitet
2. Med hjälp av transient- och virusinfektionsanalyser kommer utredarna att avgöra om stimulering av HBO1 HAT-aktivitet av E1A förstärker bildningen av pre-replikativt komplex (Pre-RC) och om E1A-inducerad HAT-aktivitet kvalitativt och kvantitativt förändrar H4-acetyleringen vid ursprungsregionerna.
3. utredarna kommer att avgöra om E1A-stimulering av HAT-aktivitet av HBO1 bidrar till DNA-re-replikation.

FORSKNINGSDESIGN OCH METODER:

Målet med denna studie är att fastställa om stimulering av HBO1 HAT-aktivitet av E1A (i) förstärker initiering (ii) inducerar kvalitativa och kvantitativa förändringar i acetylering av H4 K5, K8 och K12 vid ursprungsregionen, och (iii) förbättrar re- replikering som sker i E1A+-celler. Om ökad HAT-aktivitet kan stimulera en eller flera av dessa funktioner, kan det förklara hur denna egenskap hos E1A skulle bidra till induktionen av avvikande DNA-replikation.

1. E1A binder till WT och HAT-brist HBO1.

   utredarna kommer först att avgöra om E1A binder direkt till HBO1 genom att utföra GST-bindning och in vivo co-IP-experiment. Om bindning bekräftas kommer utredarna att kartlägga bindningsställena på båda proteinerna. utredarna kommer sedan att isolera mutanter av båda proteinerna som upphäver interaktionerna. Alla E1A-mutanter kommer att utvärderas för deras interaktioner med Rb och p300 och endast mutanter som behåller sin förmåga att binda till dessa proteiner kommer att användas. Det kommer att vara nödvändigt att isolera en HBO1-mutant som bibehåller E1A-bindningskapacitet men saknar HAT-aktivitet. En allmänt använd HAT-brist mutant G435A kommer att användas i dessa studier. Om E1A binder till denna mutant, kommer det att vara en värdefull mutant för att bekräfta att E1A-inducerad HAT-aktivitet är avgörande för stimulering av replikationsinitiering. Om denna HBO1-mutant inte binder till E1A, kommer det att vara viktigt att isolera nya HBO1-mutanter som behåller E1A-bindningskapacitet men saknar HAT-aktivitet.

2. Roll av E1A-inducerad HBO1 HAT-aktivitet i ursprungsaktivering:

   Först kommer utredarna att avgöra om E1A associerar med replikationsursprung och om denna association kräver HBO1. utredarna kommer att använda MCM4-ursprunget som kartläggs i den intergena regionen mellan PRKDC och (proteinkinas, DNA-aktiverad, katalytisk polypeptid) och MCM4-gener. Först kommer utredarna att transfektera U2OS-celler med plasmider som uttrycker relevanta proteiner och sedan bestämma deras beläggning i ursprungssekvenser med hjälp av ChIP-analyser. Plasmider som uttrycker epitopmärkt WT HBO1 eller mutantderivat tillsammans med plasmider som uttrycker WT- eller mutanta E1A-proteiner kommer att uttryckas i U2OS-celler, varefter ockupationen av dessa proteiner på ursprungsregioner kommer att kvantifieras med användning av antikroppar som lämpligt. Typiskt i dessa experiment, med användning av relevanta antikroppar, utförs ChIP-analyser med primerpar som omfattar ursprungsregioner och även regioner som är långt ifrån ursprung. Beläggningen av initieringsfaktorer ökar flera gånger i ursprungsregionen jämfört med den för 2KB uppströms eller nedströms regioner. Laddning av MCM-komplex tillsammans med Cdt1 på origo är en indikation på att initiering av replikation sker i det ursprunget och vanligtvis analyseras i ChIP-re-ChIP-analyser enligt följande: Först kommer laddning av HBO1 till origo att bekräftas med hjälp av epitopspecifika antikroppar i det första chippet. Anti-HBO1-fällningarna kommer att omchipas med anti-MCM3-antikroppar. Laddning av MCM3-helikas till ursprung sker efter Cdt1-bindning och beror på HBO1 HAT-aktivitet. Normala mängder av MCM3 kommer att detekteras efter åter-ChIP-ing i E1A+ kontrollprover. Om reducerad mängd MCM3 återvinns i reChIP-analyser när mutant E1A eller HBO1 mutant (t.ex. HBO1 G435A) används, skulle det indikera att stimulering av HAT-aktivitet av E1A är avgörande för maximal ursprungsaktivitet i E1A+-celler. Denna typ av analys som framgångsrikt har använts av andra har avsevärd flexibilitet genom att mutanta proteiner snabbt kan analyseras. Dessa ChIP-reChiP-analyser kommer att upprepas i olika kombinationer för att bestämma E1A-belastningen.

   Dessa resultat kommer att utvidgas till virusinfektionsanalyser. G1-specifika celler som isolerats genom läkemedelsbehandling kommer att infekteras med Ad-vektorer som uttrycker epitopmärkta proteiner efter behov. Associationen av E1A och HBO1 och deras muterade derivat kommer att bestämmas. Denna analys kommer att tillåta oss att bekräfta effekten av E1A-stimulerad HAT-aktivitet vid ursprungsbränning och studera effekterna av E1A på ursprungsbränning, om någon, förutom att öka HAT-aktiviteten av HBO1. Till exempel involverar inte c-Myc-induktion av E1A HAT-aktivitet.

3. Effekter av E1A inducerade HBO1 HAT-aktivitet vid acetylering av H4, K5, K8 och K12.

   För att bedöma detta kommer utredarna att chippa kromatinet framställt från virusinfekterade celler med ursprungsspecifika primrar och epitopspecifika antikroppar som är lämpligt för att detektera ursprungsladdning av HBO1. utredarna kommer sedan att chippa om ChIP-fällningarna med anti-H4-tetra-Ac-antikroppar för att detektera K5-, K8- och K12-acetylering. I celler som uttrycker E1A och HBO1 kommer H4-acetyleringen att öka avsevärt jämfört med celler infekterade med enbart HBO1-virus. H4-acetylering kan påverkas beroende på vilka mutanter som används.

4. E1A stimulerade HBO1 HAT-aktivitet vid re-replikation.

   Överuttryck av HBO1 har visat sig inducera DNA-replikation. För att avgöra om E1A använder HBO1 för att inducera re-replikation genom att stimulera HBO1 HAT-aktiviteten, kommer utredarna att infektera S-fasanrikade celler (isolerade genom dubbelt tymidinblock) med Ad-virus som uttrycker WT- eller mutanta E1A-proteiner tillsammans med Ad-vektorer som uttrycker HBO1-varianter (t.ex. HAT inaktiv), låt infektionen fortsätta efter behov och kvantifiera sedan populationen av celler som innehåller >4N DNA-innehåll med hjälp av flödescytometer. Om E1A-simulerad HBO1 HAT-aktivitet är viktig för re-replikation kommer HAT-defekta HBO1-mutanter inte att inducera re-replikation ens i närvaro av E1A. E1A-mutanter som inte kan binda till HBO1 kommer också att visa en liknande fenotyp.

5. E1A-effekter på H4-acetyleringar i re-replikerande ursprung:

   För att studera H4-acetyleringarna i re-replikerande ursprung, behöver forskarna veta vilka av cellulära ursprung som genomgår re-replikation i E1A+-celler i sen S-fas. utredarna planerar att identifiera ursprungen aktiverade i E1A+-celler inklusive de som replikerar. När utredarna identifierat ett eller två re-replikerande ursprung, kommer utredarna att kvantifiera acetyleringarna med hjälp av dessa ursprung i celler som uttrycker epitopmärkta WT och mutanta HBO1-alleler och E1A. utredarna förutser kvalitativ eller kvantitativ (eller båda) i H4-acetyleringar på grund av E1A.

6. Förväntade resultat och fallgropar:

I slutet av alla föreslagna experiment förväntar sig utredarna att avgöra om stimulering av HBO1 HAT-aktivitet av E1A är avgörande för ursprungsaktivering i E1A+-celler och om E1A-inducerad HAT-aktivitet har en roll i re-replikation. Utredarna förutser inga tekniska eller andra problem, inklusive att skaffa relevanta reagenser.