Effet de l'oncogène adénovirus E1A sur la dynamique de réplication de l'ADN

ARRIÈRE-PLAN:

La protéine E1A de 243 acides aminés (également connue sous le nom de petite protéine E1A, transformant la protéine E1A) codée par l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus humain (Ad) de type 2 ou 5 a été étudiée dans divers contextes, y compris comme modèle coopérant avec une oncoprotéine, une apoptose protéine inductrice et comme protéine oncolytique thérapeutique. Toutes ces propriétés sont associées à sa capacité à induire rapidement la phase S dans une variété de cellules. E1A orchestre la plupart de ces effets en interagissant avec un ensemble de complexes de remodelage de la chromatine, y compris les protéines de la famille Rb et les protéines HAT p300 et CBP.

L'induction d'E2F par les interactions E1A-Rb-HDAC est bien documentée alors que les conséquences des interactions E1A-p300/CBP dans la progression du cycle cellulaire ne sont pas claires. Des études antérieures ont démontré que p300/CBP empêche l'entrée prématurée des cellules quiescentes en phase S en réprimant la transcription de c-Myc via un complexe répresseur tripartite composé de p300, YY1, HDAC3. E1A se lie à p300 et dissocie le complexe répresseur pour induire la phase S. L'induction de c-Myc par ce mécanisme contribue à l'induction d'une réponse aux dommages de l'ADN et à une réplication aberrante de l'ADN cellulaire qui conduit à une instabilité génomique. Dans une étude récemment publiée, il a été démontré que E1A induit le facteur pivot d'initiation de la réplication de l'ADN Cdt1 à des niveaux élevés, ce qui entraîne une augmentation de l'activité d'origine de la réplication et, à la fin de la phase S, une induction de la réponse aux dommages de l'ADN et de la réplication de l'ADN cellulaire. En utilisant le test de fibre d'ADN à molécule unique, il a été découvert que E1A induit des changements significatifs dans la dynamique de la réplication de l'ADN et semble induire des changements globaux dans l'activation de l'origine.

Cdt1 est un facteur clé d'initiation de la réplication de l'ADN dont les niveaux oscillent au cours de la progression du cycle cellulaire. À la fin de G1, ses niveaux augmentent pour initier la réplication de l'ADN. Au début de la phase S, il est rapidement dégradé par la ligase E3 de sorte que les origines qui sont déjà déclenchées une fois ne se déclenchent pas à nouveau en phase S et qu'une réplication dans un seul cycle cellulaire ne se produise pas. La dégradation altérée de Cdt1 en phase S par la ligase E3 est le mécanisme majeur par lequel l'ADN cellulaire subit une re-réplication. Il a été découvert que dans les cellules exprimant E1A, les niveaux de Cdt1 restent élevés en phase S, ce qui suggère une dégradation inefficace de Cdt1 qui peut contribuer à une réplication étendue de l'ADN cellulaire que les chercheurs ont observée à la fin de la phase S.

La protéine de la famille Myst HBO1 (Myst2, KAT7) est une histone acétyl transférase qui joue un rôle majeur dans l'initiation de la réplication et contribue également à la réplication de l'ADN. HBO1 interagit directement avec Cdt1 et fonctionne comme un coactivateur de Cdt1 dans l'initiation de la réplication. Il s'associe également à l'origine de la réplication et stimule l'activation de l'origine en acétylant H4 K5, K8 et K12. La surexpression de HBO1 induit la réplication de l'ADN. L'enrichissement des modifications de la chromatine, y compris l'acétylation des histones H4 aux origines, influence fortement l'activation de l'origine. Ainsi, E1A en l'absence d'une multitude de signaux de prolifération stimulés par le sérum, force les cellules à entrer en phase S en utilisant plusieurs mécanismes de compensation. Le programme incontrôlé de réplication de l'ADN cellulaire provoque une polyploïdie qui est la marque du cancer. Il est passionnant qu'un oncogène viral tel que E1A modifie le programme de réplication de l'ADN cellulaire. Cela soulève un certain nombre de questions importantes liées au mécanisme de stress de réplication induit par un oncogène viral. Par exemple, comment E1A induit-il la re-réplication de l'ADN ? La stimulation E1A de HBO1 modifie-t-elle le mécanisme d'initiation et si les modifications de la chromatine médiées par HBO1 aux origines favorisent la re-réplication ?

OBJECTIF SPECIFIQUE DE L'ETUDE :

Notre objectif spécifique est de déterminer si oui ou non la stimulation de l'activité HBO1 par E1A joue un rôle dans la réplication dérégulée de l'ADN, et si c'est le cas, d'en déterminer le mécanisme.

1. À l'aide de tests standard, les chercheurs détermineront si E1A se lie à HBO1 pour induire son activité HAT
2. À l'aide d'essais d'infection transitoire et virale, les chercheurs détermineront si la stimulation de l'activité HBO1 HAT par E1A améliore la formation du complexe pré-réplicatif (pré-RC) et si l'activité HAT induite par E1A modifie qualitativement et quantitativement l'acétylation H4 dans les régions d'origine.
3. les enquêteurs détermineront si la stimulation par E1A de l'activité HAT de HBO1 contribue à la réplication de l'ADN.

CONCEPTION ET MÉTHODES DE RECHERCHE :

Le but de cette étude est de déterminer si la stimulation de l'activité HBO1 HAT par E1A (i) améliore l'initiation (ii) induit des changements qualitatifs et quantitatifs dans l'acétylation de H4 K5, K8 et K12 au niveau de la région d'origine, et (iii) améliore la réactivation. réplication qui se produit dans les cellules E1A+. Si une activité HAT accrue peut stimuler une ou plusieurs de ces fonctions, cela pourrait expliquer comment cette propriété de E1A contribuerait à l'induction d'une réplication aberrante de l'ADN.

1. Liaison E1A à HBO1 déficient en WT et HAT.

   les enquêteurs détermineront d'abord si E1A se lie directement à HBO1 en effectuant les expériences de liaison GST et de co-IP in vivo. Si la liaison est confirmée, les chercheurs cartographieront les sites de liaison sur les deux protéines. les chercheurs isoleront ensuite des mutants des deux protéines qui abolissent les interactions. Tous les mutants E1A seront évalués pour leurs interactions avec Rb et p300 et seuls les mutants qui conservent leur capacité à se lier à ces protéines seront utilisés. Il sera nécessaire d'isoler un mutant HBO1 qui conserve la capacité de liaison à E1A mais qui est dépourvu de l'activité HAT. Un mutant G435A déficient en HAT largement utilisé sera utilisé dans ces études. Si E1A se lie à ce mutant, ce sera un mutant précieux pour confirmer que l'activité HAT induite par E1A est essentielle pour la stimulation de l'initiation de la réplication. Si ce mutant HBO1 ne se lie pas à E1A, il sera important d'isoler de nouveaux mutants HBO1 qui conservent la capacité de liaison E1A mais manquent d'activité HAT.

2. Rôle de l'activité HBO1 HAT induite par E1A dans l'activation de l'origine :

   Tout d'abord, les chercheurs détermineront si E1A s'associe à des origines de réplication et si cette association nécessite HBO1. les chercheurs utiliseront l'origine MCM4 qui se situe dans la région intergénique entre les gènes PRKDC et (Protein Kinase, DNA-Activated, Catalytic Polypeptide) et MCM4. Tout d'abord, les chercheurs transfecteront des cellules U2OS avec des plasmides exprimant des protéines pertinentes, puis détermineront leur occupation dans les séquences d'origine à l'aide de tests ChIP. Les plasmides exprimant un épitope étiqueté WT HBO1 ou des dérivés mutants ainsi que des plasmides exprimant des protéines WT ou mutantes E1A seront exprimés dans des cellules U2OS, puis l'occupation de ces protéines sur les régions d'origine sera quantifiée à l'aide d'anticorps, le cas échéant. Généralement, dans ces expériences, à l'aide d'anticorps pertinents, les tests ChIP sont effectués avec des paires d'amorces englobant des régions d'origine et également des régions éloignées de l'origine. L'occupation des facteurs d'initiation est multipliée par plusieurs dans la région d'origine par rapport à celle des régions de 2 Ko en amont ou en aval. Le chargement du complexe MCM avec Cdt1 sur les origines est une indication que l'initiation de la réplication se produit dans cette origine et est généralement testée dans les tests ChIP-re-ChIP comme suit : Tout d'abord, le chargement de HBO1 aux origines sera confirmé à l'aide d'anticorps spécifiques à l'épitope dans la première puce. Les précipités anti-HBO1 seront re-ChIPed avec des anticorps anti-MCM3. Le chargement de l'hélicase MCM3 aux origines se produit après la liaison de Cdt1 et dépend de l'activité de HBO1 HAT. Des quantités normales de MCM3 seront détectées après re-ChIP-ing dans les échantillons de contrôle E1A+. Si une quantité réduite de MCM3 est récupérée dans les tests reChIP lorsque le mutant E1A ou le mutant HBO1 (par ex. HBO1 G435A) est utilisé, cela indiquerait que la stimulation de l'activité HAT par E1A est essentielle pour une activité d'origine maximale dans les cellules E1A+. Ce type de dosage qui a été utilisé avec succès par d'autres a une flexibilité considérable en ce que les protéines mutantes peuvent être rapidement dosées. Ces tests ChIP-reChiP seront répétés dans différentes combinaisons pour déterminer la charge E1A.

   Ces résultats seront étendus aux tests d'infection virale. Les cellules spécifiques de G1 isolées par traitement médicamenteux seront infectées avec des vecteurs Ad exprimant des protéines marquées par un épitope, le cas échéant. L'association de E1A et HBO1 et de leurs dérivés mutants sera déterminée. Ce test nous permettra de confirmer l'effet de l'activité HAT stimulée par E1A dans le déclenchement d'origine et d'étudier les effets de E1A sur le déclenchement d'origine, le cas échéant, autre que l'augmentation de l'activité HAT de HBO1. Par exemple, l'induction de c-Myc par E1A n'implique pas d'activité HAT.

3. Effets de l'activité HAT HBO1 induite par E1A dans l'acétylation de H4, K5, K8 et K12.

   Pour évaluer cela, les enquêteurs puceront la chromatine préparée à partir de cellules infectées par le virus avec les amorces spécifiques à l'origine et les anticorps spécifiques à l'épitope, le cas échéant, pour détecter le chargement d'origine de HBO1. les enquêteurs re-puceront ensuite les précipités de puce à l'aide d'anticorps anti-H4 tétra-Ac pour détecter l'acétylation de K5, K8 et K12. Dans les cellules exprimant E1A et HBO1, l'acétylation de H4 sera considérablement augmentée par rapport aux cellules infectées par le virus HBO1 seul. L'acétylation H4 peut être affectée selon les mutants utilisés.

4. E1A a stimulé l'activité de HBO1 HAT dans la réplication.

   Il a été démontré que la surexpression de HBO1 induisait la réplication de l'ADN. Pour déterminer si E1A utilise HBO1 pour induire une re-réplication en stimulant l'activité de HBO1 HAT, les chercheurs infecteront des cellules enrichies en phase S (isolées par un double bloc de thymidine) avec des virus Ad exprimant les protéines WT ou mutantes E1A ainsi que des vecteurs Ad exprimant des variants HBO1 (par exemple. CHAPEAU inactif), permettre à l'infection de se dérouler selon les besoins, puis quantifier la population de cellules contenant> 4N contenu en ADN à l'aide d'un cytomètre en flux. Si l'activité HBO1 HAT simulée par E1A est importante pour la re-réplication, les mutants HBO1 déficients en HAT n'induiront pas de re-réplication même en présence de E1A. Les mutants E1A qui ne peuvent pas se lier à HBO1 montreront également un phénotype similaire.

5. Effets d'E1A sur les acétylations H4 dans les origines de réplication :

   Afin d'étudier les acétylations H4 dans les origines de re-réplication, les chercheurs doivent savoir lesquelles des origines cellulaires subissent une re-réplication dans les cellules E1A + en phase S tardive. les chercheurs envisagent d'identifier les origines activées dans les cellules E1A+, y compris celles qui se répliquent. Une fois que les enquêteurs auront identifié une ou deux origines de réplication, ils quantifieront les acétylations à l'aide de ces origines dans des cellules exprimant des allèles WT marqués par un épitope et HBO1 mutant et E1A. les enquêteurs anticipent qualitatifs ou quantitatifs (ou les deux) dans les acétylations de H4 dues à E1A.

6. Résultats attendus et écueils :

À la fin de toutes les expériences proposées, les chercheurs s'attendent à déterminer si la stimulation de l'activité HAT HBO1 par E1A est essentielle pour l'activation de l'origine dans les cellules E1A + et si l'activité HAT induite par E1A joue un rôle dans la réplication. Les enquêteurs n'anticipent aucun problème technique ou autre, y compris l'obtention des réactifs pertinents.