Efecto del oncogén E1A del adenovirus en la dinámica de replicación del ADN

FONDO:

La proteína E1A de 243 aminoácidos (también conocida como proteína E1A pequeña, proteína E1A transformadora) codificada por el extremo izquierdo del genoma del adenovirus humano (Ad) tipo 2 o 5 se ha estudiado en varios contextos, incluido como modelo de oncoproteína cooperante, una apoptosis proteína inductora y como proteína oncolítica terapéutica. Todas estas propiedades están asociadas con su capacidad para inducir rápidamente la fase S en una variedad de células. E1A orquesta la mayoría de estos efectos al interactuar con una variedad de complejos de remodelación de cromatina, incluidas las proteínas de la familia Rb y las proteínas HAT p300 y CBP.

La inducción de E2F por interacciones E1A-Rb-HDAC está bien documentada, mientras que las consecuencias de las interacciones E1A-p300/CBP en la progresión del ciclo celular no están claras. Estudios previos demostraron que p300/CBP previene la entrada prematura de células inactivas en la fase S al reprimir la transcripción de c-Myc a través de un complejo represor tripartito que consta de p300, YY1, HDAC3. E1A se une a p300 y disocia el complejo represor para inducir la fase S. La inducción de c-Myc por este mecanismo contribuye a la inducción de la respuesta al daño del ADN y la replicación aberrante del ADN celular que conduce a la inestabilidad genómica. En un estudio publicado recientemente, se demostró que E1A induce el factor fundamental de iniciación de la replicación del ADN Cdt1 a niveles altos, lo que da como resultado una mayor actividad del origen de la replicación y, en la fase S tardía, la inducción de la respuesta al daño del ADN y la re-replicación del ADN celular. Usando el ensayo de fibra de ADN de molécula única, se descubrió que E1A induce cambios significativos en la dinámica de la replicación del ADN y parece inducir cambios globales en la activación del origen.

Cdt1 es un factor fundamental de iniciación de la replicación del ADN cuyos niveles oscilan durante la progresión del ciclo celular. A finales de G1, sus niveles aumentan para iniciar la replicación del ADN. Al comienzo de la fase S, la ligasa E3 lo degrada rápidamente, de modo que los orígenes que ya se activaron una vez no se activan nuevamente en la fase S y no se produce una nueva replicación dentro de un solo ciclo celular. La degradación deteriorada de Cdt1 en la fase S por la ligasa E3 es el principal mecanismo por el cual el ADN celular experimenta una nueva replicación. Se descubrió que en las células que expresan E1A, los niveles de Cdt1 permanecen altos en la fase S, lo que sugiere una degradación ineficiente de Cdt1 que puede contribuir a una extensa replicación del ADN celular que los investigadores observaron en la fase S tardía.

La proteína de la familia Myst HBO1 (Myst2, KAT7) es una histona acetil transferasa que juega un papel importante en el inicio de la replicación y también contribuye a la replicación del ADN. HBO1 interactúa directamente con Cdt1 y funciona como un coactivador de Cdt1 en el inicio de la replicación. También se asocia con el origen de la replicación y estimula la activación del origen al acetilar H4 K5, K8 y K12. La sobreexpresión de HBO1 induce la replicación del ADN. El enriquecimiento de las modificaciones de la cromatina, incluida la acetilación de las histonas H4 en los orígenes, influye fuertemente en la activación del origen. Por lo tanto, E1A, en ausencia de una multitud de señales de proliferación estimuladas por suero, obliga a las células a entrar en la fase S utilizando varios mecanismos compensatorios. El programa de replicación del ADN celular descontrolado provoca poliploidía, que es el sello distintivo del cáncer. Es emocionante que un oncogén viral como E1A altere el programa de replicación del ADN celular. Esto plantea una serie de preguntas importantes relacionadas con el mecanismo de estrés de replicación inducido por un oncogén viral. Por ejemplo, ¿cómo induce E1A la replicación del ADN? ¿La estimulación E1A de HBO1 altera el mecanismo de iniciación y si las modificaciones de cromatina mediadas por HBO1 en los orígenes promueven la replicación?

OBJETIVO ESPECÍFICO DEL ESTUDIO:

Nuestro objetivo específico es determinar si la estimulación de la actividad de HBO1 por E1A juega un papel en la replicación desregulada del ADN y, si lo hace, determinar el mecanismo.

1. Usando ensayos estándar, los investigadores determinarán si E1A se une a HBO1 para inducir su actividad HAT.
2. Usando ensayos de infección transitoria y de virus, los investigadores determinarán si la estimulación de la actividad HAT de HBO1 por E1A mejora la formación del complejo pre-replicativo (Pre-RC) y si la actividad HAT inducida por E1A cambia cualitativa y cuantitativamente la acetilación H4 en las regiones de origen.
3. los investigadores determinarán si la estimulación de E1A de la actividad HAT de HBO1 contribuye a la replicación del ADN.

DISEÑO Y MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN:

El objetivo de este estudio es determinar si la estimulación de la actividad HAT de HBO1 por E1A (i) mejora la iniciación (ii) induce cambios cualitativos y cuantitativos en la acetilación de H4 K5, K8 y K12 en la región de origen, y (iii) mejora la re- replicación que ocurre en las células E1A+. Si el aumento de la actividad HAT puede estimular una o más de estas funciones, podría explicar cómo esta propiedad de E1A contribuiría a la inducción de la replicación aberrante del ADN.

1. Unión de E1A a HBO1 deficiente en WT y HAT.

   los investigadores primero determinarán si E1A se une directamente a HBO1 mediante la realización de experimentos de unión a GST y co-IP in vivo. Si se confirma la unión, los investigadores mapearán los sitios de unión en ambas proteínas. Luego, los investigadores aislarán mutantes de ambas proteínas que eliminan las interacciones. Todos los mutantes de E1A se evaluarán en cuanto a sus interacciones con Rb y p300 y solo se utilizarán los mutantes que conserven su capacidad para unirse a estas proteínas. Será necesario aislar un mutante de HBO1 que conserve la capacidad de unión a E1A pero que carezca de actividad HAT. En estos estudios se utilizará un mutante G435A deficiente en HAT ampliamente utilizado. Si E1A se une a este mutante, será un mutante valioso para confirmar que la actividad HAT inducida por E1A es crítica para la estimulación del inicio de la replicación. Si este mutante de HBO1 no se une a E1A, será importante aislar nuevos mutantes de HBO1 que conserven la capacidad de unión a E1A pero carezcan de actividad HAT.

2. Papel de la actividad HAT de HBO1 inducida por E1A en la activación del origen:

   Primero, los investigadores determinarán si E1A se asocia con orígenes de replicación y si esta asociación requiere HBO1. los investigadores utilizarán el origen de MCM4 que mapea en la región intergénica entre PRKDC y (proteína quinasa, polipéptido catalítico activado por ADN) y genes MCM4. Primero, los investigadores transfectarán células U2OS con plásmidos que expresen proteínas relevantes y luego determinarán su ocupación en las secuencias de origen utilizando ensayos ChIP. Los plásmidos que expresan epítopo etiquetado WT HBO1 o derivados mutantes junto con los plásmidos que expresan proteínas WT o E1A mutante se expresarán en células U2OS, luego se cuantificará la ocupación de estas proteínas en las regiones de origen utilizando anticuerpos según corresponda. Por lo general, en estos experimentos, utilizando anticuerpos relevantes, los ensayos de ChIP se realizan con pares de cebadores que abarcan regiones de origen y también regiones que están lejos del origen. La ocupación de los factores de iniciación aumenta varias veces en la región de origen en comparación con la de las regiones aguas arriba o aguas abajo de 2 KB. La carga del complejo MCM junto con Cdt1 en los orígenes es una indicación de que el inicio de la replicación ocurre en ese origen y, por lo general, se analiza en ensayos ChIP-re-ChIP de la siguiente manera: Primero, la carga de HBO1 en los orígenes se confirmará usando anticuerpos específicos del epítopo en el primer chip. Los precipitados anti-HBO1 se volverán a fragmentar con anticuerpos anti-MCM3. La carga de la helicasa MCM3 a los orígenes se produce después de la unión de Cdt1 y depende de la actividad HAT de HBO1. Se detectarán cantidades normales de MCM3 después de volver a chipear en las muestras de control E1A+. Si se recupera una cantidad reducida de MCM3 en los ensayos reChIP cuando el mutante E1A o el mutante HBO1 (p. HBO1 G435A), indicaría que la estimulación de la actividad HAT por parte de E1A es fundamental para la actividad de origen máxima en las células E1A+. Este tipo de ensayo que otros han utilizado con éxito tiene una flexibilidad considerable en el sentido de que las proteínas mutantes pueden ensayarse rápidamente. Estos ensayos ChIP-reChiP se repetirán en diferentes combinaciones para determinar la carga de E1A.

   Estos resultados se extenderán a los ensayos de infección por virus. Las células específicas de G1 aisladas mediante tratamiento farmacológico se infectarán con vectores Ad que expresen proteínas marcadas con epítopo según corresponda. Se determinará la asociación de E1A y HBO1 y sus derivados mutantes. Este ensayo nos permitirá confirmar el efecto de la actividad HAT estimulada por E1A en la activación de origen y estudiar los efectos de E1A en la activación de origen, si los hay, además de aumentar la actividad HAT de HBO1. Por ejemplo, la inducción de c-Myc por E1A no implica actividad HAT.

3. Efectos de la actividad HAT de HBO1 inducida por E1A en la acetilación de H4, K5, K8 y K12.

   Para evaluar esto, los investigadores analizarán la cromatina preparada a partir de células infectadas por virus con cebadores específicos de origen y anticuerpos específicos de epítopo, según corresponda, para detectar la carga de origen de HBO1. Luego, los investigadores volverán a chipear los precipitados de ChIP usando anticuerpos anti-H4 tetra-Ac para detectar la acetilación de K5, K8 y K12. En las células que expresan E1A y HBO1, la acetilación de H4 aumentará considerablemente en comparación con las células infectadas con el virus HBO1 solo. La acetilación de H4 puede verse afectada según los mutantes utilizados.

4. E1A estimuló la actividad HAT de HBO1 en la re-replicación.

   Se ha demostrado que la sobreexpresión de HBO1 induce la replicación del ADN. Para determinar si E1A utiliza HBO1 para inducir la replicación mediante la estimulación de la actividad HAT de HBO1, los investigadores infectarán células enriquecidas en fase S (aisladas mediante bloqueo doble de timidina) con virus Ad que expresen las proteínas WT o E1A mutante junto con vectores Ad que expresen variantes de HBO1. (p.ej. HAT inactivo), permita que la infección continúe según sea necesario y luego cuantifique la población de células que contienen un contenido de ADN > 4N utilizando un citómetro de flujo. Si la actividad HAT de HBO1 simulada por E1A es importante para la re-replicación, los mutantes de HBO1 defectuosos en HAT no inducirán la re-replicación incluso en presencia de E1A. Los mutantes de E1A que no pueden unirse a HBO1 también mostrarán un fenotipo similar.

5. Efectos de E1A sobre las acetilaciones de H4 en orígenes replicantes:

   Para estudiar las acetilaciones de H4 en los orígenes de re-replicación, los investigadores necesitan saber cuáles de los orígenes celulares experimentan re-replicación en las células E1A+ en la fase S tardía. los investigadores planean identificar los orígenes activados en las células E1A+, incluidas las que se vuelven a replicar. Una vez que los investigadores identifiquen uno o dos orígenes de replicación, cuantificarán las acetilaciones utilizando estos orígenes en células que expresan alelos WT etiquetados con epítopo y HBO1 mutante y E1A. los investigadores prevén acetilaciones cualitativas o cuantitativas (o ambas) en H4 debidas a E1A.

6. Resultados esperados y trampas:

Al final de todos los experimentos propuestos, los investigadores esperan determinar si la estimulación de la actividad HAT de HBO1 por E1A es crítica para la activación del origen en las células E1A+ y si la actividad HAT inducida por E1A tiene un papel en la re-replicación. Los investigadores no prevén ningún problema técnico o de otro tipo, incluida la obtención de los reactivos pertinentes.