Effetto dell'oncogene Adenovirus E1A sulle dinamiche di replicazione del DNA

SFONDO:

La proteina E1A di 243 aminoacidi (nota anche come piccola proteina E1A, proteina trasformante E1A) codificata dall'estremità sinistra del genoma umano di tipo 2 o 5 dell'adenovirus (Ad) è stata studiata in vari contesti tra cui un modello di oncoproteina cooperante, un'apoptosi proteina inducente e come proteina oncolitica terapeutica. Tutte queste proprietà sono associate alla sua capacità di indurre rapidamente la fase S in una varietà di cellule. E1A orchestra la maggior parte di questi effetti interagendo con una serie di complessi di rimodellamento della cromatina, comprese le proteine ​​della famiglia Rb e le proteine ​​HAT p300 e CBP.

L'induzione di E2F da parte delle interazioni E1A-Rb-HDAC è ben documentata mentre le conseguenze delle interazioni E1A-p300/CBP nella progressione del ciclo cellulare non sono chiare. Precedenti studi hanno dimostrato che p300/CBP previene l'ingresso prematuro delle cellule quiescenti nella fase S reprimendo la trascrizione di c-Myc attraverso un complesso repressore tripartito costituito da p300, YY1, HDAC3. E1A si lega a p300 e dissocia il complesso repressore per indurre la fase S. L'induzione di c-Myc mediante questo meccanismo contribuisce all'induzione della risposta al danno del DNA e alla replicazione aberrante del DNA cellulare che porta all'instabilità genomica. In uno studio pubblicato di recente, è stato dimostrato che E1A induce il fattore fondamentale di inizio della replicazione del DNA Cdt1 a livelli elevati con conseguente aumento dell'attività di origine della replicazione e nella fase S tardiva, induzione della risposta al danno del DNA e della replicazione del DNA cellulare. Utilizzando il test della fibra di DNA a singola molecola, è stato scoperto che E1A induce cambiamenti significativi nella dinamica della replicazione del DNA e sembra indurre cambiamenti globali nell'attivazione dell'origine.

Cdt1 è un fattore fondamentale di inizio della replicazione del DNA i cui livelli oscillano durante la progressione del ciclo cellulare. Alla fine di G1, i suoi livelli aumentano per avviare la replicazione del DNA. All'inizio della fase S viene prontamente degradato dalla ligasi E3 in modo che le origini che sono già state attivate una volta non si attivino nuovamente nella fase S e non si verifichi la ri-replicazione all'interno di un singolo ciclo cellulare. La degradazione compromessa di Cdt1 in fase S da parte della ligasi E3 è il principale meccanismo mediante il quale il DNA cellulare subisce la ri-replicazione. È stato scoperto che nelle cellule che esprimono E1A i livelli di Cdt1 rimangono elevati nella fase S, suggerendo una degradazione inefficiente di Cdt1 che può contribuire a un'ampia ri-replicazione del DNA cellulare che i ricercatori hanno osservato nella tarda fase S.

La proteina della famiglia Myst HBO1 (Myst2, KAT7) è un'istone acetil transferasi che svolge un ruolo importante nell'inizio della replicazione e contribuisce anche alla ri-replicazione del DNA. HBO1 interagisce direttamente con Cdt1 e funziona come coattivatore di Cdt1 nell'avvio della replica. Si associa anche all'origine della replicazione e stimola l'attivazione dell'origine acetilando H4 K5, K8 e K12. La sovraespressione di HBO1 induce la replicazione del DNA. L'arricchimento delle modifiche della cromatina inclusa l'acetilazione degli istoni H4 alle origini influenza fortemente l'attivazione dell'origine. Pertanto, E1A in assenza di una moltitudine di segnali di proliferazione stimolati dal siero, costringe le cellule a entrare nella fase S utilizzando diversi meccanismi compensatori. Il programma di replicazione del DNA cellulare incontrollato provoca la poliploidia che è il segno distintivo del cancro. È emozionante che un oncogene virale come E1A alteri il programma di replicazione del DNA cellulare. Ciò solleva una serie di importanti domande relative al meccanismo dello stress replicativo indotto da un oncogene virale. Ad esempio, in che modo l'E1A induce la replicazione del DNA? La stimolazione E1A di HBO1 altera il meccanismo di iniziazione e se le modifiche della cromatina mediate da HBO1 alle origini promuovono la ri-replicazione?

SCOPO SPECIFICO DELLO STUDIO:

Il nostro obiettivo specifico è determinare se la stimolazione dell'attività HBO1 da parte di E1A abbia o meno un ruolo nella replicazione deregolamentata del DNA e, in tal caso, determinarne il meccanismo.

1. Utilizzando test standard, i ricercatori determineranno se E1A si lega a HBO1 per indurre la sua attività HAT
2. Utilizzando test di infezione transitoria e virale, i ricercatori determineranno se la stimolazione dell'attività HAT HBO1 da parte di E1A migliora la formazione del complesso pre-replicativo (Pre-RC) e se l'attività HAT indotta da E1A modifica qualitativamente e quantitativamente l'acetilazione H4 nelle regioni di origine.
3. i ricercatori determineranno se la stimolazione E1A dell'attività HAT di HBO1 contribuisce alla replicazione del DNA.

DISEGNO E METODI DELLA RICERCA:

L'obiettivo di questo studio è determinare se la stimolazione dell'attività HBO1 HAT da parte di E1A (i) migliora l'inizio (ii) induce cambiamenti qualitativi e quantitativi nell'acetilazione di H4 K5, K8 e K12 nella regione di origine e (iii) migliora la ri- replicazione che avviene nelle cellule E1A+. Se l'aumento dell'attività HAT può stimolare una o più di queste funzioni, potrebbe spiegare come questa proprietà di E1A contribuirebbe all'induzione della replicazione aberrante del DNA.

1. E1A che si lega a HBO1 carente di WT e HAT.

   i ricercatori determineranno innanzitutto se E1A si lega direttamente a HBO1 eseguendo il legame GST e gli esperimenti di co-IP in vivo. Se il legame è confermato, gli investigatori mapperanno i siti di legame su entrambe le proteine. i ricercatori isoleranno quindi i mutanti di entrambe le proteine ​​​​che aboliscono le interazioni. Tutti i mutanti E1A saranno valutati per le loro interazioni con Rb e p300 e verranno utilizzati solo i mutanti che conservano la loro capacità di legarsi a queste proteine. Sarà necessario isolare un mutante HBO1 che mantenga la capacità di legame E1A ma manchi dell'attività HAT. In questi studi verrà utilizzato un mutante G435A carente di HAT ampiamente utilizzato. Se E1A si lega a questo mutante, sarà un prezioso mutante per confermare che l'attività HAT indotta da E1A è fondamentale per la stimolazione dell'inizio della replicazione. Se questo mutante HBO1 non si lega a E1A, sarà importante isolare nuovi mutanti HBO1 che mantengono la capacità di legame E1A ma mancano di attività HAT.

2. Ruolo dell'attività HBO1 HAT indotta da E1A nell'attivazione dell'origine:

   Innanzitutto, gli investigatori determineranno se E1A si associa a origini di replica e se questa associazione richiede HBO1. i ricercatori utilizzeranno l'origine MCM4 che mappa nella regione intergenica tra i geni PRKDC e (Protein Kinase, DNA-Activated, Catalytic Polypeptide) e MCM4. In primo luogo, gli investigatori trasfetteranno le cellule U2OS con plasmidi che esprimono proteine ​​​​rilevanti, quindi determineranno la loro occupazione nelle sequenze di origine utilizzando i saggi ChIP. I plasmidi che esprimono l'epitopo marcato con WT HBO1 oi derivati ​​mutanti insieme ai plasmidi che esprimono le proteine ​​WT o E1A mutate saranno espressi nelle cellule U2OS, quindi l'occupazione di queste proteine ​​nelle regioni di origine sarà quantificata usando gli anticorpi appropriati. Tipicamente in questi esperimenti, utilizzando anticorpi pertinenti, i saggi ChIP vengono eseguiti con coppie di primer che comprendono regioni di origine e anche regioni lontane dall'origine. L'occupazione dei fattori di inizio è aumentata di diverse volte nella regione di origine rispetto a quella delle regioni a monte oa valle di 2 KB. Il caricamento del complesso MCM insieme a Cdt1 sulle origini è un'indicazione che l'inizio della replicazione si verifica in quell'origine e di solito viene analizzato nei test ChIP-re-ChIP come segue: in primo luogo, il caricamento di HBO1 alle origini sarà confermato utilizzando anticorpi specifici dell'epitopo in il primo chip. I precipitati anti-HBO1 saranno ri-chipati con anticorpi anti-MCM3. Il caricamento dell'elicasi MCM3 alle origini si verifica dopo il legame con Cdt1 e dipende dall'attività HAT HBO1. Quantità normali di MCM3 saranno rilevate dopo il re-ChIP-ing nei campioni di controllo E1A+. Se nei test reChIP viene recuperata una quantità ridotta di MCM3 quando il mutante E1A o il mutante HBO1 (ad es. HBO1 G435A), indicherebbe che la stimolazione dell'attività HAT da parte di E1A è fondamentale per la massima attività di origine nelle cellule E1A+. Questo tipo di analisi che è stato utilizzato con successo da altri ha una notevole flessibilità in quanto le proteine ​​mutanti possono essere analizzate rapidamente. Questi saggi ChIP-reChiP verranno ripetuti in diverse combinazioni per determinare il caricamento E1A.

   Questi risultati saranno estesi ai test di infezione da virus. Cellule G1 specifiche isolate mediante trattamento farmacologico saranno infettate con vettori Ad che esprimono proteine ​​marcate con epitopi come appropriato. Verrà determinata l'associazione di E1A e HBO1 e dei loro derivati ​​mutanti. Questo test ci consentirà di confermare l'effetto dell'attività HAT stimolata da E1A nell'attivazione dell'origine e di studiare gli effetti dell'E1A sull'attivazione dell'origine, se presenti, oltre all'aumento dell'attività HAT di HBO1. Ad esempio, l'induzione di c-Myc da parte di E1A non comporta attività HAT.

3. Gli effetti di E1A hanno indotto l'attività HBO1 HAT nell'acetilazione di H4, K5, K8 e K12.

   Per valutare ciò, gli investigatori eseguiranno il ChIP della cromatina preparata da cellule infette da virus con i primer specifici dell'origine e gli anticorpi specifici dell'epitopo, a seconda dei casi, per rilevare il caricamento dell'origine di HBO1. gli investigatori ri-chiperanno quindi i precipitati di ChIP utilizzando anticorpi anti-H4 tetra-Ac per rilevare l'acetilazione di K5, K8 e K12. Nelle cellule che esprimono E1A e HBO1, l'acetilazione di H4 sarà notevolmente aumentata rispetto alle cellule infettate solo dal virus HBO1. L'acetilazione H4 può essere influenzata a seconda dei mutanti utilizzati.

4. E1A ha stimolato l'attività HBO1 HAT nella ri-replicazione.

   È stato dimostrato che la sovraespressione di HBO1 induce la replicazione del DNA. Per determinare se E1A utilizza HBO1 per indurre la ri-replicazione stimolando l'attività HBO1 HAT, i ricercatori infetteranno cellule arricchite in fase S (isolate mediante doppio blocco di timidina) con virus Ad che esprimono le proteine ​​​​WT o mutanti E1A insieme a vettori Ad che esprimono varianti HBO1 (per esempio. HAT inattivo), consentire all'infezione di procedere secondo necessità, quindi quantificare la popolazione di cellule contenenti un contenuto di DNA >4N utilizzando il citometro a flusso. Se l'attività HAT HBO1 simulata da E1A è importante per la ri-replicazione, i mutanti HBO1 difettosi HAT non indurranno la ri-replicazione anche in presenza di E1A. Anche i mutanti E1A che non possono legarsi a HBO1 mostreranno un fenotipo simile.

5. Effetti E1A sulle acetilazioni H4 nelle origini di replicazione:

   Per studiare le acetilazioni H4 nelle origini di replicazione, i ricercatori devono sapere quale delle origini cellulari subisce la replicazione nelle cellule E1A + nella fase S tardiva. i ricercatori stanno pianificando di identificare le origini attivate nelle cellule E1A +, comprese quelle che si replicano nuovamente. Una volta che gli investigatori identificano una o due origini di replicazione, gli investigatori quantificheranno le acetilazioni utilizzando queste origini in cellule che esprimono WT marcato con epitopo e alleli HBO1 mutanti ed E1A. i ricercatori anticipano qualitativo o quantitativo (o entrambi) nelle acetilazioni H4 dovute a E1A.

6. Risultati attesi e insidie:

Alla fine di tutti gli esperimenti proposti, i ricercatori si aspettano di determinare se la stimolazione dell'attività HAT HBO1 da parte di E1A sia critica per l'attivazione dell'origine nelle cellule E1A+ e se l'attività HAT indotta da E1A abbia un ruolo nella ri-replicazione. Gli investigatori non prevedono alcun problema tecnico o di altro tipo, incluso l'ottenimento di reagenti pertinenti.