Effekt av adenovirus E1A onkogen på DNA-replikasjonsdynamikk

BAKGRUNN:

TDet 243 aminosyre store E1A-proteinet (også kjent som lite E1A-protein, transformerende E1A-protein) kodet av venstre ende av humant adenovirus (Ad) type 2- eller 5-genom har blitt studert i forskjellige sammenhenger, inkludert som et modellsamarbeidende onkoprotein, en apoptose induserende protein, og som et terapeutisk onkolytisk protein. Alle disse egenskapene er assosiert med dens evne til raskt å indusere S-fase i en rekke celler. E1A orkestrerer de fleste av disse effektene ved å samhandle med en rekke kromatinremodelleringskomplekser, inkludert Rb-familieproteinene og HAT-proteinene p300 og CBP.

Induksjonen av E2F ved E1A-Rb-HDAC-interaksjoner er godt dokumentert, mens konsekvensene av E1A-p300/CBP-interaksjoner i cellesyklusprogresjon ikke er klare. Tidligere studier viste at p300/CBP forhindrer for tidlig inntreden av hvilende celler i S-fasen ved å undertrykke c-Myc-transkripsjon gjennom et tredelt repressorkompleks bestående av p300, YY1, HDAC3. E1A binder seg til p300 og dissosierer repressorkomplekset for å indusere S-fase. Induksjon av c-Myc ved denne mekanismen bidrar til induksjon av DNA-skaderespons og avvikende cellulær DNA-replikasjon som fører til genomisk ustabilitet. I en nylig publisert studie ble det vist at E1A induserer den pivotale DNA-replikasjonsinitieringsfaktoren Cdt1 til høye nivåer som resulterer i økt replikasjonsopprinnelsesaktivitet og i sen S-fase, induksjon av DNA-skaderespons og cellulær DNA-re-replikasjon. Ved å bruke enkeltmolekyl-DNA-fiberanalysen ble det oppdaget at E1A induserer betydelige endringer i dynamikken til DNA-replikasjon og ser ut til å indusere globale endringer i opprinnelsesaktivering.

Cdt1 er en sentral DNA-replikasjonsinitieringsfaktor hvis nivåer svinger under cellesyklusprogresjon. På slutten av G1 stiger nivåene for å starte DNA-replikasjon. Ved begynnelsen av S-fasen blir den raskt degradert av E3-ligasen slik at opprinnelser som allerede er avfyrt én gang, ikke avfyres igjen i S-fasen og re-replikasjon innen en enkelt cellesyklus ikke forekommer. Svekket nedbrytning av Cdt1 i S-fase av E3-ligasen er den viktigste mekanismen som cellulære DNA gjennomgår re-replikasjon. Det ble oppdaget at i E1A-uttrykkende celler forblir Cdt1-nivåer høye i S-fasen, noe som tyder på en ineffektiv nedbrytning av Cdt1 som kan bidra til omfattende re-replikasjon av cellulært DNA som etterforskerne observerte i sen S-fase.

Myst-familieproteinet HBO1 (Myst2, KAT7) er en histonacetyltransferase som spiller en stor rolle i replikasjonsinitiering og bidrar også til DNA-re-replikasjon. HBO1 interagerer direkte med Cdt1 og fungerer som en koaktivator av Cdt1 i replikasjonsinitiering. Det assosieres også med replikasjonsopprinnelse og stimulerer startaktivering ved å acetylere H4 K5, K8 og K12. Overekspresjon av HBO1 induserer DNA-re-replikasjon. Anrikningen av kromatinmodifikasjoner inkludert acetylering av H4-histoner ved opprinnelsen påvirker opprinnelsesaktiveringen sterkt. Dermed tvinger E1A i fravær av en mengde serumstimulerte spredningssignaler cellene til å gå inn i S-fasen ved å bruke flere kompenserende mekanismer. Ukontrollert cellulært DNA-replikasjonsprogram forårsaker polyploidi som er kjennetegnet på kreft. Det er spennende at et viralt onkogen som E1A endrer det cellulære DNA-replikasjonsprogrammet. Dette reiser en rekke viktige spørsmål knyttet til mekanismen for replikasjonsstress indusert av et viralt onkogen. For eksempel, hvordan induserer E1A DNA-re-replikasjon? Forandrer E1A-stimulering av HBO1 initieringsmekanismen og om HBO1-medierte kromatinmodifikasjoner ved opprinnelsen fremmer re-replikasjon?

SPESIFIKKE MÅL MED STUDIEN:

Vårt spesifikke mål er å avgjøre hvorvidt stimulering av HBO1-aktivitet av E1A spiller en rolle i deregulert DNA-replikasjon, og hvis den gjør det, å bestemme mekanismen.

1. Ved å bruke standardanalyser vil etterforskerne bestemme om E1A binder seg til HBO1 for å indusere dens HAT-aktivitet
2. Ved å bruke transient- og virusinfeksjonsanalyser vil etterforskerne avgjøre om stimulering av HBO1 HAT-aktivitet av E1A forbedrer dannelsen av pre-replikativ kompleks (Pre-RC) og om E1A-indusert HAT-aktivitet kvalitativt og kvantitativt endrer H4-acetyleringen ved opprinnelsesregionene.
3. etterforskerne vil avgjøre om E1A-stimulering av HAT-aktivitet av HBO1 bidrar til DNA-re-replikasjon.

FORSKNINGSDESIGN OG METODER:

Målet med denne studien er å bestemme om stimulering av HBO1 HAT-aktivitet av E1A (i) øker initiering (ii) induserer kvalitative og kvantitative endringer i acetylering av H4 K5, K8 og K12 ved opprinnelsesregionen, og (iii) øker re- replikasjon som skjer i E1A+-celler. Hvis økt HAT-aktivitet kan stimulere en eller flere av disse funksjonene, kan det forklare hvordan denne egenskapen til E1A vil bidra til induksjon av avvikende DNA-replikasjon.

1. E1A-binding til WT- og HAT-mangel HBO1.

   etterforskerne vil først avgjøre om E1A binder seg direkte til HBO1 ved å utføre GST-binding og in vivo co-IP-eksperimenter. Hvis bindingen er bekreftet, vil etterforskerne kartlegge bindingsstedene på begge proteinene. etterforskerne vil da isolere mutanter av begge proteinene som opphever interaksjonene. Alle E1A-mutanter vil bli evaluert for deres interaksjoner med Rb og p300, og kun mutanter som beholder sin evne til å binde seg til disse proteinene vil bli brukt. Det vil være nødvendig å isolere en HBO1-mutant som beholder E1A-bindingskapasitet, men som mangler HAT-aktiviteten. En mye brukt HAT-mangel mutant G435A vil bli brukt i disse studiene. Hvis E1A binder seg til denne mutanten, vil det være en verdifull mutant for å bekrefte at E1A-indusert HAT-aktivitet er kritisk for stimulering av replikasjonsinitiering. Hvis denne HBO1-mutanten ikke binder seg til E1A, vil det være viktig å isolere nye HBO1-mutanter som beholder E1A-bindingskapasitet, men mangler HAT-aktivitet.

2. Rollen til E1A-indusert HBO1 HAT-aktivitet i opprinnelsesaktivering:

   Først vil etterforskerne avgjøre om E1A assosieres med replikasjonsopprinnelse og om denne assosiasjonen krever HBO1. etterforskerne vil bruke MCM4-opprinnelsen som kartlegger i den intergene regionen mellom PRKDC og (proteinkinase, DNA-aktivert, katalytisk polypeptid) og MCM4 gener. Først vil etterforskerne transfisere U2OS-celler med plasmider som uttrykker relevante proteiner, og deretter bestemme deres belegg i opprinnelsessekvenser ved hjelp av ChIP-analyser. Plasmider som uttrykker epitopmerket WT HBO1 eller mutante derivater sammen med plasmider som uttrykker WT eller mutante E1A-proteiner vil bli uttrykt i U2OS-celler, deretter vil okkupasjon av disse proteinene på opprinnelsesregioner kvantifiseres ved bruk av antistoffer etter behov. Vanligvis i disse eksperimentene, ved bruk av relevante antistoffer, utføres ChIP-analyser med primerpar som omfatter opprinnelsesregioner og også regioner som er langt fra opprinnelse. Opptak av initieringsfaktorer økes flere ganger i opprinnelsesregionen sammenlignet med 2KB oppstrøms- eller nedstrømsregioner. Lasting av MCM-kompleks sammen med Cdt1 på origo er en indikasjon på at initiering av replikasjon skjer i det origo og vanligvis analysert i ChIP-re-ChIP-analyser som følger: Først vil lasting av HBO1 til origo bekreftes ved bruk av epitopspesifikke antistoffer i den første chipen. Anti-HBO1-utfellingene vil bli re-ChIPed med anti-MCM3 antistoffer. Lasting av MCM3-helikase til opprinnelsen skjer etter Cdt1-binding og avhenger av HBO1 HAT-aktivitet. Normale mengder MCM3 vil bli oppdaget etter re-ChIP-ing i E1A+ kontrollprøver. Hvis redusert mengde MCM3 gjenvinnes i reChIP-analyser når mutant E1A eller HBO1 mutant (f.eks. HBO1 G435A) brukes, vil det indikere at stimulering av HAT-aktivitet av E1A er kritisk for maksimal opprinnelsesaktivitet i E1A+-celler. Denne typen assay som har vært vellykket brukt av andre har betydelig fleksibilitet ved at mutante proteiner kan analyseres raskt. Disse ChIP-reChiP-analysene vil gjentas i forskjellige kombinasjoner for å bestemme E1A-belastningen.

   Disse resultatene vil bli utvidet til virusinfeksjonsanalyser. G1-spesifikke celler isolert ved medikamentell behandling vil bli infisert med Ad-vektorer som uttrykker epitopmerkede proteiner etter behov. Foreningen av E1A og HBO1 og deres mutante derivater vil bli bestemt. Denne analysen vil tillate oss å bekrefte effekten av E1A-stimulert HAT-aktivitet i opprinnelsesfyring og studere effekten av E1A på opprinnelsesfyring, hvis noen, annet enn å øke HAT-aktiviteten til HBO1. For eksempel involverer ikke c-Myc-induksjon av E1A HAT-aktivitet.

3. Effekter av E1A induserte HBO1 HAT-aktivitet i acetyleringen av H4, K5, K8 og K12.

   For å vurdere dette, vil etterforskerne ChIP kromatinet fremstilt fra virusinfiserte celler med opprinnelsesspesifikke primere og epitopspesifikke antistoffer som er passende for å oppdage opprinnelsesbelastning av HBO1. etterforskerne vil deretter re-chipe ChIP-utfellingene ved å bruke anti-H4 tetra-Ac antistoffer for å oppdage K5, K8 og K12 acetylering. I celler som uttrykker E1A og HBO1, vil H4-acetylering økes betraktelig sammenlignet med celler infisert med HBO1-virus alene. H4-acetylering kan påvirkes avhengig av mutantene som brukes.

4. E1A stimulerte HBO1 HAT-aktivitet i re-replikasjon.

   Overekspresjon av HBO1 har vist seg å indusere DNA-replikasjon. For å bestemme om E1A bruker HBO1 til å indusere re-replikasjon ved å stimulere HBO1 HAT-aktiviteten, vil etterforskerne infisere S-fase-anrikede celler (isolert med dobbel tymidinblokk) med Ad-virus som uttrykker WT- eller mutante E1A-proteiner sammen med Ad-vektorer som uttrykker HBO1-varianter (f.eks. HAT inaktiv), la infeksjonen fortsette etter behov, og kvantifiser deretter populasjonen av celler som inneholder >4N DNA-innhold ved hjelp av flowcytometer. Hvis E1A-simulert HBO1 HAT-aktivitet er viktig for re-replikasjon, vil HAT-defekte HBO1-mutanter ikke indusere re-replikasjon selv i nærvær av E1A. E1A-mutanter som ikke kan binde seg til HBO1 vil også vise en lignende fenotype.

5. E1A-effekter på H4-acetylering i re-replikerende opprinnelse:

   For å studere H4-acetyleringene i re-replikerende opprinnelser, må etterforskerne vite hvilke av cellulær opprinnelse som gjennomgår re-replikasjon i E1A+-celler i sen S-fase. etterforskerne planlegger å identifisere opprinnelsene som er aktivert i E1A+-celler, inkludert de som replikerer. Når etterforskerne har identifisert en eller to re-replikerende opprinnelser, vil etterforskerne kvantifisere acetyleringene ved å bruke disse opprinnelsene i celler som uttrykker epitopmerkede WT og mutante HBO1 alleler og E1A. etterforskerne forventer kvalitativ eller kvantitativ (eller begge deler) i H4-acetyleringer på grunn av E1A.

6. Forventede resultater og fallgruver:

På slutten av alle de foreslåtte eksperimentene forventer etterforskerne å finne ut om stimulering av HBO1 HAT-aktivitet av E1A er kritisk for opprinnelsesaktivering i E1A+-celler og om E1A-indusert HAT-aktivitet har en rolle i re-replikasjon. Etterforskerne forventer ingen tekniske eller andre problemer, inkludert å skaffe relevante reagenser.