Effekt af adenovirus E1A onkogen på DNA-replikationsdynamik

BAGGRUND:

TDet 243 aminosyre store E1A-protein (også kendt som lille E1A-protein, transformerende E1A-protein) kodet af den venstre ende af det humane adenovirus (Ad) type 2- eller 5-genom er blevet undersøgt i forskellige sammenhænge, ​​herunder som et model for samarbejdende oncoprotein, en apoptose inducerende protein og som et terapeutisk onkolytisk protein. Alle disse egenskaber er forbundet med dets evne til hurtigt at inducere S-fase i en række forskellige celler. E1A orkestrerer de fleste af disse effekter ved at interagere med en række kromatin-ombygningskomplekser, herunder Rb-familieproteinerne og HAT-proteinerne p300 og CBP.

Induktionen af ​​E2F ved E1A-Rb-HDAC-interaktioner er veldokumenteret, hvorimod konsekvenserne af E1A-p300/CBP-interaktioner i cellecyklusprogression ikke er klare. Tidligere undersøgelser viste, at p300/CBP forhindrer for tidlig indtræden af ​​hvilende celler i S-fasen ved at undertrykke c-Myc-transkription gennem et tredelt repressorkompleks bestående af p300, YY1, HDAC3. E1A binder til p300 og dissocierer repressorkomplekset for at inducere S-fase. Induktion af c-Myc ved denne mekanisme bidrager til induktionen af ​​DNA-skaderespons og afvigende cellulær DNA-replikation, som fører til genomisk ustabilitet. I et nyligt offentliggjort studie blev det vist, at E1A inducerer den pivotale DNA-replikationsinitieringsfaktor Cdt1 til høje niveauer, hvilket resulterer i øget replikationsstartaktivitet og i sen S-fase, induktion af DNA-skaderespons og cellulær DNA-replikation. Ved at bruge enkeltmolekyle DNA-fiberanalysen blev det opdaget, at E1A inducerer betydelige ændringer i dynamikken af ​​DNA-replikation og ser ud til at inducere globale ændringer i oprindelsesaktivering.

Cdt1 er en pivotal DNA-replikationsinitieringsfaktor, hvis niveauer svinger under cellecyklusprogression. I slutningen af ​​G1 stiger dets niveauer for at starte DNA-replikation. I begyndelsen af ​​S-fasen nedbrydes det omgående af E3-ligasen, således at oprindelser, der allerede er affyret én gang, ikke affyres igen i S-fasen, og re-replikation inden for en enkelt cellecyklus forekommer ikke. Forringet nedbrydning af Cdt1 i S-fase af E3-ligasen er den vigtigste mekanisme, hvorved det cellulære DNA gennemgår re-replikation. Det blev opdaget, at i E1A-udtrykkende celler forbliver Cdt1-niveauer høje i S-fasen, hvilket tyder på en ineffektiv nedbrydning af Cdt1, som kan bidrage til omfattende re-replikation af cellulært DNA, som efterforskerne observerede i sen S-fase.

Myst-familieproteinet HBO1 (Myst2, KAT7) er en histonacetyltransferase, der spiller en stor rolle i replikationsinitiering og også bidrager til DNA-re-replikation. HBO1 interagerer direkte med Cdt1 og fungerer som en coactivator af Cdt1 i replikationsinitiering. Det associeres også med replikationsorigin og stimulerer startaktivering ved at acetylere H4 K5, K8 og K12. Overekspression af HBO1 inducerer DNA-re-replikation. Berigelsen af ​​kromatinmodifikationer, herunder acetylering af H4-histoner ved oprindelsen, påvirker i høj grad oprindelsesaktiveringen. Således tvinger E1A i fravær af et væld af serumstimulerede proliferationssignaler celler til at gå ind i S-fase ved hjælp af flere kompensatoriske mekanismer. Ukontrolleret cellulært DNA-replikationsprogram forårsager polyploidi, der er kendetegnet ved kræft. Det er spændende, at et viralt onkogen såsom E1A ændrer det cellulære DNA-replikationsprogram. Dette rejser en række vigtige spørgsmål relateret til mekanismen for replikationsstress induceret af et viralt onkogen. For eksempel, hvordan inducerer E1A DNA-re-replikation? Ændrer E1A-stimulering af HBO1 initieringsmekanismen, og hvorvidt HBO1-medierede kromatinmodifikationer ved oprindelsen fremmer re-replikation?

SPECIFIKKE MÅL MED UNDERSØGELSEN:

Vores specifikke mål er at bestemme, hvorvidt stimulering af HBO1-aktivitet af E1A spiller en rolle i dereguleret DNA-replikation, og hvis den gør det, at bestemme mekanismen.

1. Ved hjælp af standardassays vil efterforskerne bestemme, om E1A binder til HBO1 for at inducere dets HAT-aktivitet
2. Ved hjælp af transient- og virusinfektionsassays vil efterforskerne bestemme, om stimulering af HBO1 HAT-aktivitet med E1A øger dannelsen af ​​det præ-replikative kompleks (Pre-RC), og om E1A-induceret HAT-aktivitet kvalitativt og kvantitativt ændrer H4-acetyleringen ved oprindelsesregionerne.
3. efterforskerne vil afgøre, om E1A-stimulering af HAT-aktivitet af HBO1 bidrager til DNA-re-replikation.

FORSKNINGSDESIGN OG METODER:

Målet med denne undersøgelse er at bestemme, om stimulering af HBO1 HAT-aktivitet af E1A (i) øger initiering (ii) inducerer kvalitative og kvantitative ændringer i acetylering af H4 K5, K8 og K12 i oprindelsesregionen, og (iii) øger re- replikation, der forekommer i E1A+ celler. Hvis øget HAT-aktivitet kan stimulere en eller flere af disse funktioner, kan det forklare, hvordan denne egenskab ved E1A ville bidrage til induktionen af ​​afvigende DNA-replikation.

1. E1A-binding til WT- og HAT-mangel HBO1.

   efterforskerne vil først afgøre, om E1A binder direkte til HBO1 ved at udføre GST-binding og in vivo co-IP eksperimenter. Hvis binding bekræftes, vil efterforskerne kortlægge bindingsstederne på begge proteiner. efterforskerne vil derefter isolere mutanter af begge proteiner, der ophæver interaktionerne. Alle E1A-mutanter vil blive evalueret for deres interaktioner med Rb og p300, og kun mutanter, der bevarer deres evne til at binde til disse proteiner, vil blive brugt. Det vil være nødvendigt at isolere en HBO1-mutant, der bevarer E1A-bindingskapacitet, men mangler HAT-aktiviteten. En meget brugt HAT-deficient mutant G435A vil blive brugt i disse undersøgelser. Hvis E1A binder til denne mutant, vil det være en værdifuld mutant for at bekræfte, at E1A-induceret HAT-aktivitet er kritisk for stimulering af replikationsinitiering. Hvis denne HBO1-mutant ikke binder til E1A, vil det være vigtigt at isolere nye HBO1-mutanter, som bevarer E1A-bindingskapacitet, men mangler HAT-aktivitet.

2. Rolle af E1A-induceret HBO1 HAT-aktivitet i oprindelsesaktivering:

   For det første vil efterforskerne afgøre, om E1A associerer med replikationsorigin, og om denne association kræver HBO1. efterforskerne vil bruge MCM4-oprindelsen, som kortlægger i den intergene region mellem PRKDC og (proteinkinase, DNA-aktiveret, katalytisk polypeptid) og MCM4 gener. Først vil efterforskerne transficere U2OS-celler med plasmider, der udtrykker relevante proteiner, og derefter bestemme deres belægning i oprindelsessekvenser ved hjælp af ChIP-assays. Plasmider, der udtrykker epitopmærket WT HBO1 eller mutante derivater sammen med plasmider, der udtrykker WT eller mutante E1A-proteiner, vil blive udtrykt i U2OS-celler, hvorefter besættelse af disse proteiner på oprindelsesregioner vil blive kvantificeret ved anvendelse af antistoffer efter behov. Typisk i disse eksperimenter udføres ChIP-assays under anvendelse af relevante antistoffer med primerpar, der omfatter oprindelsesregioner og også regioner, der er langt fra oprindelsen. Besættelse af initieringsfaktorer øges adskillige gange i oprindelsesregionen sammenlignet med 2KB opstrøms- eller nedstrømsregioner. Indlæsning af MCM-kompleks sammen med Cdt1 på oprindelsen er en indikation af, at initiering af replikation finder sted i denne oprindelse og normalt analyseret i ChIP-re-ChIP-assays som følger: For det første vil belastning af HBO1 til oprindelsen blive bekræftet ved hjælp af epitopspecifikke antistoffer i den første chip. Anti-HBO1-præcipitaterne vil blive genchippet med anti-MCM3-antistoffer. Indlæsning af MCM3-helicase til oprindelsen sker efter Cdt1-binding og afhænger af HBO1 HAT-aktivitet. Normale mængder af MCM3 vil blive detekteret efter re-ChIP-ing i E1A+ kontrolprøver. Hvis reduceret mængde af MCM3 genvindes i reChIP-assays, når mutant E1A eller HBO1 mutant (f. HBO1 G435A) anvendes, ville det indikere, at stimulering af HAT-aktivitet med E1A er kritisk for maksimal oprindelsesaktivitet i E1A+-celler. Denne type assay, som er blevet anvendt med succes af andre, har betydelig fleksibilitet, idet mutante proteiner hurtigt kan analyseres. Disse ChIP-reChiP-assays gentages i forskellige kombinationer for at bestemme E1A-belastningen.

   Disse resultater vil blive udvidet til virusinfektionsassays. G1-specifikke celler isoleret ved lægemiddelbehandling vil blive inficeret med Ad-vektorer, der udtrykker epitop-mærkede proteiner efter behov. Forening af E1A og HBO1 og deres mutante derivater vil blive bestemt. Denne analyse vil give os mulighed for at bekræfte virkningen af ​​E1A-stimuleret HAT-aktivitet i oprindelsesfyring og studere virkningerne af E1A på oprindelsesfyring, hvis nogen, bortset fra at øge HAT-aktiviteten af ​​HBO1. For eksempel involverer c-Myc-induktion af E1A ikke HAT-aktivitet.

3. Effekter af E1A inducerede HBO1 HAT-aktivitet i acetyleringen af ​​H4, K5, K8 og K12.

   For at vurdere dette vil efterforskerne chippe kromatinet fremstillet fra virusinficerede celler med de oprindelsesspecifikke primere og epitopspecifikke antistoffer efter behov for at påvise oprindelsesbelastning af HBO1. efterforskerne vil derefter genchippe ChIP-præcipitaterne ved hjælp af anti-H4-tetra-Ac-antistoffer til at påvise K5-, K8- og K12-acetylering. I celler, der udtrykker E1A og HBO1, vil H4-acetylering være øget betydeligt sammenlignet med celler inficeret med HBO1-virus alene. H4-acetylering kan blive påvirket afhængigt af de anvendte mutanter.

4. E1A stimulerede HBO1 HAT aktivitet i re-replikation.

   Overekspression af HBO1 har vist sig at inducere DNA-replikation. For at afgøre, om E1A bruger HBO1 til at inducere re-replikation ved at stimulere HBO1 HAT-aktiviteten, vil efterforskerne inficere S-faseberigede celler (isoleret ved dobbelt thymidinblok) med Ad-vira, der udtrykker WT- eller mutante E1A-proteiner sammen med Ad-vektorer, der udtrykker HBO1-varianter (f.eks. HAT inaktiv), lad infektionen fortsætte efter behov og kvantificer derefter populationen af ​​celler, der indeholder >4N DNA-indhold ved hjælp af flowcytometer. Hvis E1A-simuleret HBO1 HAT-aktivitet er vigtig for re-replikation, vil HAT-defekte HBO1-mutanter ikke inducere re-replikation, selv i nærvær af E1A. E1A-mutanter, der ikke kan binde til HBO1, vil også vise en lignende fænotype.

5. E1A-virkninger på H4-acetyleringer i re-replikerende oprindelse:

   For at studere H4-acetyleringerne i re-replikerende oprindelser, skal efterforskerne vide, hvilke af cellulære oprindelser der gennemgår re-replikation i E1A+ celler i sen S-fase. efterforskerne planlægger at identificere oprindelsen aktiveret i E1A+ celler, inklusive dem, der re-replikerer. Når efterforskerne har identificeret en eller to re-replikerende oprindelser, vil efterforskerne kvantificere acetyleringerne ved hjælp af disse oprindelser i celler, der udtrykker epitopmærkede WT og mutante HBO1 alleler og E1A. efterforskerne forventer kvalitativ eller kvantitativ (eller begge dele) i H4-acetyleringer på grund af E1A.

6. Forventede resultater og faldgruber:

Ved afslutningen af ​​alle de foreslåede eksperimenter forventer efterforskerne at bestemme, om stimulering af HBO1 HAT-aktivitet med E1A er kritisk for oprindelsesaktivering i E1A+-celler, og om E1A-induceret HAT-aktivitet har en rolle i re-replikation. Efterforskerne forudser ikke tekniske eller andre problemer, herunder at skaffe relevante reagenser.