Efeito do Oncogene Adenovirus E1A na Dinâmica de Replicação do DNA

FUNDO:

A proteína E1A de 243 aminoácidos (também conhecida como proteína E1A pequena, proteína E1A transformadora) codificada pela extremidade esquerda do genoma do adenovírus humano (Ad) tipo 2 ou 5 foi estudada em vários contextos, incluindo como uma oncoproteína modelo cooperante, uma apoptose proteína indutora e como proteína oncolítica terapêutica. Todas essas propriedades estão associadas à sua capacidade de induzir rapidamente a fase S em uma variedade de células. E1A orquestra a maioria desses efeitos interagindo com uma série de complexos de remodelação da cromatina, incluindo as proteínas da família Rb e as proteínas HAT p300 e CBP.

A indução de E2F por interações E1A-Rb-HDAC está bem documentada, enquanto as consequências das interações E1A-p300/CBP na progressão do ciclo celular não são claras. Estudos anteriores demonstraram que p300/CBP previne a entrada prematura de células quiescentes na fase S reprimindo a transcrição de c-Myc através de um complexo repressor tripartido que consiste em p300, YY1, HDAC3. E1A se liga a p300 e dissocia o complexo repressor para induzir a fase S. A indução de c-Myc por este mecanismo contribui para a indução da resposta ao dano do DNA e replicação aberrante do DNA celular que leva à instabilidade genômica. Em um estudo publicado recentemente, foi demonstrado que E1A induz o fator de iniciação de replicação de DNA Cdt1 a níveis elevados, resultando em aumento da atividade de origem de replicação e na fase S tardia, indução de resposta a dano de DNA e replicação de DNA celular. Usando o ensaio de fibra de DNA de molécula única, descobriu-se que E1A induz mudanças significativas na dinâmica da replicação do DNA e parece induzir mudanças globais na ativação de origem.

Cdt1 é um fator essencial de iniciação da replicação do DNA cujos níveis oscilam durante a progressão do ciclo celular. No final de G1, seus níveis aumentam para iniciar a replicação do DNA. No início da fase S, ela é prontamente degradada pela E3 ligase, de modo que as origens que já foram disparadas uma vez não sejam disparadas novamente na fase S e não ocorra a replicação dentro de um único ciclo celular. A degradação prejudicada de Cdt1 na fase S pela ligase E3 é o principal mecanismo pelo qual o DNA celular sofre nova replicação. Foi descoberto que em células que expressam E1A, os níveis de Cdt1 permanecem altos na fase S, sugerindo uma degradação ineficiente de Cdt1, que pode contribuir para uma extensa re-replicação do DNA celular que os investigadores observaram na fase S tardia.

A proteína HBO1 da família Myst (Myst2, KAT7) é uma histona acetil transferase que desempenha um papel importante na iniciação da replicação e também contribui para a replicação do DNA. HBO1 interage diretamente com Cdt1 e funciona como um coativador de Cdt1 na iniciação da replicação. Também se associa à origem de replicação e estimula a ativação da origem por acetilação de H4 K5, K8 e K12. A superexpressão de HBO1 induz a replicação do DNA. O enriquecimento das modificações da cromatina, incluindo acetilação de histonas H4 nas origens, influencia fortemente a ativação da origem. Assim, E1A na ausência de uma multiplicidade de sinais de proliferação estimulados pelo soro, força as células a entrarem na fase S usando vários mecanismos compensatórios. O programa de replicação celular descontrolado do DNA causa poliploidia, que é a marca registrada do câncer. É emocionante que um oncogene viral como o E1A altere o programa de replicação do DNA celular. Isso levanta uma série de questões importantes relacionadas ao mecanismo de estresse de replicação induzido por um oncogene viral. Por exemplo, como E1A induz a re-replicação do DNA? A estimulação E1A de HBO1 altera o mecanismo de iniciação e se as modificações da cromatina mediadas por HBO1 nas origens promovem a re-replicação?

OBJETIVO ESPECÍFICO DO ESTUDO:

Nosso objetivo específico é determinar se a estimulação da atividade de HBO1 por E1A desempenha ou não um papel na replicação desregulada do DNA e, se o fizer, determinar o mecanismo.

1. Usando ensaios padrão, os investigadores determinarão se E1A se liga a HBO1 para induzir sua atividade HAT
2. Usando ensaios transitórios e de infecção viral, os investigadores determinarão se a estimulação da atividade HBO1 HAT por E1A aumenta a formação do complexo pré-replicativo (Pré-RC) e se a atividade HAT induzida por E1A altera qualitativa e quantitativamente a acetilação H4 nas regiões de origem.
3. os investigadores determinarão se a estimulação E1A da atividade HAT de HBO1 contribui para a replicação do DNA.

PROJETO DE PESQUISA E MÉTODOS:

O objetivo deste estudo é determinar se a estimulação da atividade HBO1 HAT por E1A (i) aumenta a iniciação (ii) induz alterações qualitativas e quantitativas na acetilação de H4 K5, K8 e K12 na região de origem e (iii) aumenta a re- replicação que ocorre nas células E1A+. Se o aumento da atividade de HAT puder estimular uma ou mais dessas funções, isso poderia explicar como essa propriedade de E1A contribuiria para a indução da replicação aberrante do DNA.

1. Ligação de E1A a WT e HBO1 deficiente em HAT.

   os investigadores determinarão primeiro se E1A se liga diretamente a HBO1 realizando a ligação de GST e experimentos de co-IP in vivo. Se a ligação for confirmada, os investigadores mapearão os locais de ligação em ambas as proteínas. os investigadores irão então isolar mutantes de ambas as proteínas que abolem as interações. Todos os mutantes E1A serão avaliados quanto às suas interações com Rb e p300 e apenas os mutantes que retiverem sua capacidade de se ligar a essas proteínas serão utilizados. Será necessário isolar um mutante HBO1 que retenha a capacidade de ligação de E1A, mas não tenha a atividade HAT. Um mutante deficiente em HAT amplamente utilizado, G435A, será utilizado nestes estudos. Se E1A se ligar a este mutante, será um mutante valioso para confirmar que a atividade HAT induzida por E1A é crítica para a estimulação da iniciação da replicação. Se este mutante de HBO1 não se ligar a E1A, será importante isolar novos mutantes de HBO1 que retenham a capacidade de ligação de E1A, mas não tenham atividade HAT.

2. Papel da atividade HBO1 HAT induzida por E1A na ativação de origem:

   Primeiro, os investigadores determinarão se E1A se associa a origens de replicação e se essa associação requer HBO1. os investigadores usarão a origem MCM4 que mapeia na região intergênica entre os genes PRKDC e (Proteína Quinase, Polipeptídeo Catalítico Ativado por DNA) e MCM4. Primeiro, os investigadores transfectarão células U2OS com plasmídeos que expressam proteínas relevantes e, em seguida, determinarão sua ocupação nas sequências de origem usando ensaios ChIP. Plasmídeos que expressam WT HBO1 marcado com epítopo ou derivados mutantes juntamente com plasmídeos que expressam WT ou proteínas E1A mutantes serão expressos em células U2OS, então a ocupação dessas proteínas nas regiões de origem será quantificada usando anticorpos conforme apropriado. Normalmente, nesses experimentos, usando anticorpos relevantes, os ensaios de ChIP são realizados com pares de primers abrangendo regiões de origem e também regiões distantes da origem. A ocupação dos fatores de iniciação é aumentada várias vezes na região de origem em comparação com as regiões upstream ou downstream de 2 KB. O carregamento do complexo MCM junto com Cdt1 nas origens é uma indicação de que o início da replicação ocorre nessa origem e geralmente analisado em ensaios ChIP-re-ChIP da seguinte forma: Primeiro, o carregamento de HBO1 nas origens será confirmado usando anticorpos específicos de epítopo em o primeiro CHIP. Os precipitados anti-HBO1 serão re-ChIPed com anticorpos anti-MCM3. O carregamento da helicase MCM3 nas origens ocorre após a ligação de Cdt1 e depende da atividade de HBO1 HAT. Quantidades normais de MCM3 serão detectadas após re-ChIP-ing em amostras de controle E1A+. Se uma quantidade reduzida de MCM3 for recuperada em ensaios reChIP quando o mutante E1A ou o mutante HBO1 (p. HBO1 G435A) é usado, isso indicaria que a estimulação da atividade HAT por E1A é crítica para a atividade de origem máxima em células E1A+. Este tipo de ensaio, que tem sido utilizado com sucesso por outros, tem uma flexibilidade considerável pelo facto de as proteínas mutantes poderem ser testadas rapidamente. Esses ensaios ChIP-reChiP serão repetidos em diferentes combinações para determinar a carga de E1A.

   Esses resultados serão estendidos a ensaios de infecção viral. Células específicas de G1 isoladas por tratamento medicamentoso serão infectadas com vetores Ad que expressam proteínas marcadas com epítopos, conforme apropriado. A associação de E1A e HBO1 e seus derivados mutantes será determinada. Este ensaio nos permitirá confirmar o efeito da atividade HAT estimulada por E1A no disparo de origem e estudar os efeitos de E1A no disparo de origem, se houver, além de aumentar a atividade HAT de HBO1. Por exemplo, a indução de c-Myc por E1A não envolve atividade HAT.

3. Efeitos da atividade HBO1 HAT induzida por E1A na acetilação de H4, K5, K8 e K12.

   Para avaliar isso, os investigadores irão ChIP da cromatina preparada a partir de células infectadas por vírus com os primers específicos de origem e anticorpos específicos de epítopo conforme apropriado para detectar o carregamento de origem de HBO1. os investigadores irão, então, re-chipar os precipitados de ChIP usando anticorpos anti-H4 tetra-Ac para detectar a acetilação de K5, K8 e K12. Em células que expressam E1A e HBO1, a acetilação de H4 aumentará consideravelmente em comparação com células infectadas apenas com o vírus HBO1. A acetilação de H4 pode ser afetada dependendo dos mutantes usados.

4. E1A estimulou a atividade HBO1 HAT na re-replicação.

   A superexpressão de HBO1 demonstrou induzir a replicação do DNA. Para determinar se E1A usa HBO1 na indução de re-replicação estimulando a atividade HBO1 HAT, os investigadores irão infectar células enriquecidas em fase S (isoladas por bloqueio duplo de timidina) com vírus Ad expressando as proteínas WT ou mutantes E1A juntamente com vetores Ad expressando variantes HBO1 (por exemplo. HAT inativo), permita que a infecção prossiga conforme necessário e, em seguida, quantifique a população de células contendo conteúdo de DNA> 4N usando o citômetro de fluxo. Se a atividade de HBO1 HAT simulada por E1A for importante para a re-replicação, os mutantes de HBO1 deficientes em HAT não induzirão a re-replicação mesmo na presença de E1A. Os mutantes E1A que não podem se ligar a HBO1 também apresentarão um fenótipo semelhante.

5. Efeitos de E1A nas acetilações de H4 em origens re-replicantes:

   Para estudar as acetilações H4 em origens re-replicantes, os pesquisadores precisam saber quais das origens celulares sofrem re-replicação em células E1A+ na fase S tardia. os investigadores estão planejando identificar as origens ativadas nas células E1A+, incluindo aquelas que se replicam novamente. Uma vez que os investigadores identifiquem uma ou duas origens de replicação, os investigadores irão quantificar as acetilações usando essas origens em células que expressam WT marcado com epítopo e alelos HBO1 mutantes e E1A. os investigadores antecipam qualitativo ou quantitativo (ou ambos) em acetilações de H4 devido a E1A.

6. Resultados esperados e armadilhas:

No final de todos os experimentos propostos, os pesquisadores esperam determinar se a estimulação da atividade HBO1 HAT por E1A é crítica para a ativação de origem em células E1A+ e se a atividade HAT induzida por E1A tem um papel na re-replicação. Os investigadores não antecipam quaisquer problemas técnicos ou outros, incluindo a obtenção de reagentes relevantes.