Wpływ onkogenu adenowirusa E1A na dynamikę replikacji DNA

TŁO:

Białko E1A o długości 243 aminokwasów (znane również jako małe białko E1A, białko transformujące E1A) kodowane przez lewy koniec genomu ludzkiego adenowirusa (Ad) typu 2 lub 5 było badane w różnych kontekstach, w tym jako model współpracującej onkoproteiny, apoptozy białko indukujące i jako terapeutyczne białko onkolityczne. Wszystkie te właściwości są związane z jego zdolnością do szybkiego indukowania fazy S w różnych komórkach. E1A koordynuje większość tych efektów poprzez interakcję z szeregiem kompleksów przebudowy chromatyny, w tym białek rodziny Rb oraz białek HAT p300 i CBP.

Indukcja E2F przez interakcje E1A-Rb-HDAC jest dobrze udokumentowana, podczas gdy konsekwencje interakcji E1A-p300/CBP w progresji cyklu komórkowego nie są jasne. Poprzednie badania wykazały, że p300/CBP zapobiega przedwczesnemu wejściu spoczynkowych komórek w fazę S poprzez represję transkrypcji c-Myc przez trójdzielny kompleks represorowy składający się z p300, YY1, HDAC3. E1A wiąże się z p300 i dysocjuje kompleks represora, indukując fazę S. Indukcja c-Myc przez ten mechanizm przyczynia się do indukcji odpowiedzi na uszkodzenie DNA i nieprawidłowej komórkowej replikacji DNA, co prowadzi do niestabilności genomu. W niedawno opublikowanym badaniu wykazano, że E1A indukuje kluczowy czynnik inicjacji replikacji DNA Cdt1 do wysokiego poziomu, co skutkuje zwiększoną aktywnością miejsca startu replikacji, aw późnej fazie S indukcją odpowiedzi na uszkodzenie DNA i ponowną replikacją komórkowego DNA. Za pomocą testu włókien pojedynczej cząsteczki DNA odkryto, że E1A indukuje znaczące zmiany w dynamice replikacji DNA i wydaje się indukować globalne zmiany w aktywacji miejsca pochodzenia.

Cdt1 jest kluczowym czynnikiem inicjującym replikację DNA, którego poziomy oscylują podczas postępu cyklu komórkowego. Pod koniec G1 jego poziom wzrasta, aby zainicjować replikację DNA. Na początku fazy S jest szybko degradowany przez ligazę E3, tak że inicjacje, które zostały już raz wystrzelone, nie odpalają ponownie w fazie S i nie zachodzi ponowna replikacja w ramach pojedynczego cyklu komórkowego. Upośledzona degradacja Cdt1 w fazie S przez ligazę E3 jest głównym mechanizmem, dzięki któremu DNA komórkowe ulega ponownej replikacji. Odkryto, że w komórkach wykazujących ekspresję E1A poziomy Cdt1 pozostają wysokie w fazie S, co sugeruje nieefektywną degradację Cdt1, co może przyczynić się do rozległej ponownej replikacji komórkowego DNA, którą badacze zaobserwowali w późnej fazie S.

Białko HBO1 z rodziny Myst (Myst2, KAT7) jest acetylotransferazą histonową, która odgrywa główną rolę w inicjacji replikacji, a także przyczynia się do ponownej replikacji DNA. HBO1 oddziałuje bezpośrednio z Cdt1 i działa jako koaktywator Cdt1 w inicjacji replikacji. Wiąże się również z początkiem replikacji i stymuluje aktywację początku poprzez acetylację H4, K5, K8 i K12. Nadekspresja HBO1 indukuje ponowną replikację DNA. Wzbogacenie modyfikacji chromatyny, w tym acetylacja histonów H4 na początku, silnie wpływa na aktywację początku. Zatem E1A przy braku wielu sygnałów proliferacji stymulowanej surowicą zmusza komórki do wejścia w fazę S przy użyciu kilku mechanizmów kompensacyjnych. Niekontrolowany program replikacji komórkowego DNA powoduje poliploidię, która jest cechą charakterystyczną raka. To ekscytujące, że wirusowy onkogen, taki jak E1A, zmienia program replikacji komórkowego DNA. Rodzi to szereg ważnych pytań związanych z mechanizmem stresu replikacyjnego indukowanego przez wirusowy onkogen. Na przykład, w jaki sposób E1A indukuje ponowną replikację DNA? Czy stymulacja E1A HBO1 zmienia mechanizm inicjacji i czy modyfikacje chromatyny za pośrednictwem HBO1 na początku promują ponowną replikację?

CEL SZCZEGÓŁOWY BADANIA:

Naszym szczegółowym celem jest ustalenie, czy stymulacja aktywności HBO1 przez E1A odgrywa rolę w rozregulowanej replikacji DNA, a jeśli tak, określenie mechanizmu.

1. Za pomocą standardowych testów badacze określą, czy E1A wiąże się z HBO1 w celu wywołania aktywności HAT
2. Wykorzystując testy infekcji przejściowej i wirusowej, badacze określą, czy stymulacja aktywności HBO1 HAT przez E1A zwiększa tworzenie kompleksu przedreplikacyjnego (Pre-RC) i czy indukowana przez E1A aktywność HAT jakościowo i ilościowo zmienia acetylację H4 w regionach pochodzenia.
3. badacze ustalą, czy stymulacja E1A aktywności HAT HBO1 przyczynia się do ponownej replikacji DNA.

PROJEKT BADAŃ I METODY:

Celem tego badania jest ustalenie, czy stymulacja aktywności HBO1 HAT przez E1A (i) zwiększa inicjację (ii) indukuje jakościowe i ilościowe zmiany w acetylacji H4 K5, K8 i K12 w regionie pochodzenia oraz (iii) wzmacnia ponownie replikacja zachodząca w komórkach E1A+. Jeśli zwiększona aktywność HAT może stymulować jedną lub więcej z tych funkcji, może to wyjaśniać, w jaki sposób ta właściwość E1A przyczyniłaby się do indukcji nieprawidłowej replikacji DNA.

1. Wiązanie E1A z HBO1 z niedoborem WT i HAT.

   badacze najpierw określą, czy E1A wiąże się bezpośrednio z HBO1, przeprowadzając eksperymenty z wiązaniem GST i co-IP in vivo. Jeśli wiązanie zostanie potwierdzone, badacze zmapują miejsca wiązania na obu białkach. następnie badacze wyizolują mutanty obu białek, które zniosą interakcje. Wszystkie mutanty E1A zostaną ocenione pod kątem ich interakcji z Rb i p300 i użyte zostaną tylko mutanty, które zachowują zdolność wiązania się z tymi białkami. Konieczne będzie wyizolowanie mutanta HBO1, który zachowuje zdolność wiązania E1A, ale nie ma aktywności HAT. W tych badaniach zostanie wykorzystany szeroko stosowany mutant G435A z niedoborem HAT. Jeśli E1A zwiąże się z tym mutantem, będzie to cenny mutant do potwierdzenia, że ​​indukowana przez E1A aktywność HAT jest krytyczna dla stymulacji inicjacji replikacji. Jeśli ten mutant HBO1 nie wiąże się z E1A, ważne będzie wyizolowanie nowych mutantów HBO1, które zachowują zdolność wiązania E1A, ale nie mają aktywności HAT.

2. Rola indukowanej przez E1A aktywności HBO1 HAT w aktywacji pochodzenia:

   Najpierw badacze ustalą, czy E1A wiąże się z pochodzeniem replikacji i czy to powiązanie wymaga HBO1. badacze wykorzystają pochodzenie MCM4, które odwzorowuje region międzygenowy między genami PRKDC a (kinazą białkową, polipeptydem aktywowanym DNA, katalitycznym) i MCM4. Najpierw badacze dokonają transfekcji komórek U2OS plazmidami eksprymującymi odpowiednie białka, a następnie określą ich zajętość w sekwencjach początkowych za pomocą testów ChIP. Plazmidy eksprymujące WT HBO1 znakowane epitopem lub zmutowane pochodne wraz z plazmidami eksprymującymi białka WT lub zmutowane E1A będą eksprymowane w komórkach U2OS, następnie zajęcie tych białek w regionach pochodzenia będzie oznaczane ilościowo przy użyciu odpowiednich przeciwciał. Zazwyczaj w tych eksperymentach, stosując odpowiednie przeciwciała, testy ChIP przeprowadza się z parami starterów obejmującymi regiony pochodzenia, a także regiony, które są daleko od miejsca pochodzenia. Zajętość czynników inicjacji jest kilkakrotnie zwiększona w regionie początkowym w porównaniu z regionami upstream lub downstream o wielkości 2 KB. Załadowanie kompleksu MCM wraz z Cdt1 do miejsc startowych wskazuje, że inicjacja replikacji zachodzi w tym miejscu startowym i jest zwykle oznaczana w testach ChIP-re-ChIP w następujący sposób: pierwszy chip. Wytrącony anty-HBO1 zostanie ponownie poddany chipowaniu przeciwciałami anty-MCM3. Ładowanie helikazy MCM3 do początku następuje po związaniu Cdt1 i zależy od aktywności HBO1 HAT. Normalne ilości MCM3 zostaną wykryte po ponownym chipowaniu w próbkach kontrolnych E1A+. Jeśli zmniejszona ilość MCM3 zostanie odzyskana w testach reChIP, gdy mutant E1A lub mutant HBO1 (np. HBO1 G435A), wskazywałoby to, że stymulacja aktywności HAT przez E1A ma kluczowe znaczenie dla maksymalnej aktywności pochodzenia w komórkach E1A+. Ten rodzaj testu, który był z powodzeniem stosowany przez innych, ma znaczną elastyczność, ponieważ zmutowane białka mogą być szybko oznaczane. Te testy ChIP-reChiP będą powtarzane w różnych kombinacjach, aby określić obciążenie E1A.

   Wyniki te zostaną rozszerzone na testy infekcji wirusowej. Komórki swoiste dla G1 wyizolowane przez potraktowanie lekiem będą odpowiednio zakażone wektorami Ad eksprymującymi białka znakowane epitopem. Zostanie określony związek E1A i HBO1 oraz ich zmutowanych pochodnych. Ten test pozwoli nam potwierdzić wpływ aktywności HAT stymulowanej E1A na wypalanie pochodzenia i zbadać wpływ E1A na wypalanie pochodzenia, jeśli taki istnieje, inny niż zwiększenie aktywności HAT HBO1. Na przykład indukcja c-Myc przez E1A nie obejmuje aktywności HAT.

3. Wpływ aktywności HBO1 HAT indukowanej przez E1A na acetylację H4, K5, K8 i K12.

   Aby to ocenić, badacze wykonają ChIP chromatyny przygotowanej z komórek zakażonych wirusem starterami specyficznymi dla miejsca pochodzenia i przeciwciałami specyficznymi dla epitopu, aby wykryć obciążenie HBO1 pochodzenia. następnie badacze dokonają ponownego chipowania precypitatów ChIP przy użyciu przeciwciał tetra-Ac anty-H4 w celu wykrycia acetylacji K5, K8 i K12. W komórkach wykazujących ekspresję E1A i HBO1, acetylacja H4 będzie znacznie zwiększona w porównaniu z komórkami zakażonymi samym wirusem HBO1. Na acetylację H4 może mieć wpływ w zależności od zastosowanych mutantów.

4. E1A stymulował aktywność HBO1 HAT w ponownej replikacji.

   Wykazano, że nadekspresja HBO1 indukuje replikację DNA. Aby ustalić, czy E1A wykorzystuje HBO1 do indukowania ponownej replikacji poprzez stymulację aktywności HBO1 HAT, badacze zakażą komórki wzbogacone w fazę S (wyizolowane za pomocą podwójnego bloku tymidynowego) wirusami Ad wyrażającymi WT lub zmutowane białka E1A wraz z wektorami Ad wyrażającymi warianty HBO1 (np. HAT nieaktywna), pozwolić, aby infekcja postępowała zgodnie z potrzebami, a następnie określić ilościowo populację komórek zawierających >4N DNA za pomocą cytometru przepływowego. Jeśli symulowana aktywność E1A HBO1 HAT jest ważna dla ponownej replikacji mutanty HBO1 z defektem HBO nie będą indukować ponownej replikacji nawet w obecności E1A. Mutanty E1A, które nie mogą wiązać się z HBO1, będą również wykazywać podobny fenotyp.

5. Wpływ E1A na acetylacje H4 w replikujących się miejscach pochodzenia:

   Aby zbadać acetylacje H4 w replikujących się inicjacjach, badacze muszą wiedzieć, które z inicjacji komórkowych ulegają ponownej replikacji w komórkach E1A+ w późnej fazie S. badacze planują zidentyfikować aktywowane miejsca pochodzenia w komórkach E1A+, w tym te, które ulegają ponownej replikacji. Gdy badacze zidentyfikują jedno lub dwa miejsca inicjacji replikacji, badacze określą ilościowo acetylacje przy użyciu tych miejsc inicjacji w komórkach eksprymujących znakowane epitopem allele WT i zmutowane HBO1 oraz E1A. badacze przewidują jakościowe lub ilościowe (lub oba) acetylacje H4 spowodowane E1A.

6. Oczekiwane wyniki i pułapki:

Na koniec wszystkich proponowanych eksperymentów badacze spodziewają się ustalić, czy stymulacja aktywności HBO1 HAT przez E1A ma kluczowe znaczenie dla aktywacji początku w komórkach E1A+ i czy indukowana przez E1A aktywność HAT odgrywa rolę w ponownej replikacji. Badacze nie przewidują żadnych problemów technicznych ani innych, w tym z uzyskaniem odpowiednich odczynników.