Wirkung des Adenovirus E1A-Onkogens auf die DNA-Replikationsdynamik

HINTERGRUND:

Das 243 Aminosäuren lange E1A-Protein (auch bekannt als kleines E1A-Protein, transformierendes E1A-Protein), das vom linken Ende des Genoms des humanen Adenovirus (Ad) Typ 2 oder 5 kodiert wird, wurde in verschiedenen Kontexten untersucht, einschließlich als Modell für ein kooperierendes Onkoprotein, eine Apoptose induzierendes Protein und als therapeutisches onkolytisches Protein. Alle diese Eigenschaften sind mit seiner Fähigkeit verbunden, die S-Phase in einer Vielzahl von Zellen schnell zu induzieren. E1A orchestriert die meisten dieser Effekte, indem es mit einer Reihe von Chromatin-Umbaukomplexen interagiert, einschließlich der Proteine ​​der Rb-Familie und der HAT-Proteine ​​p300 und CBP.

Die Induktion von E2F durch E1A-Rb-HDAC-Wechselwirkungen ist gut dokumentiert, während die Konsequenzen von E1A-p300/CBP-Wechselwirkungen auf die Zellzyklusprogression nicht klar sind. Frühere Studien zeigten, dass p300/CBP den vorzeitigen Eintritt ruhender Zellen in die S-Phase verhindert, indem es die c-Myc-Transkription durch einen dreiteiligen Repressorkomplex, bestehend aus p300, YY1, HDAC3, unterdrückt. E1A bindet an p300 und dissoziiert den Repressorkomplex, um die S-Phase zu induzieren. Die Induktion von c-Myc durch diesen Mechanismus trägt zur Induktion einer DNA-Schadensantwort und einer aberranten zellulären DNA-Replikation bei, was zu einer genomischen Instabilität führt. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde gezeigt, dass E1A den entscheidenden DNA-Replikationsinitiationsfaktor Cdt1 auf ein hohes Niveau induziert, was zu einer erhöhten Aktivität des Replikationsursprungs und in der späten S-Phase zur Induktion einer DNA-Schadensantwort und einer zellulären DNA-Replikation führt. Unter Verwendung des Einzelmolekül-DNA-Faserassays wurde entdeckt, dass E1A signifikante Änderungen in der Dynamik der DNA-Replikation induziert und globale Änderungen in der Ursprungsaktivierung zu induzieren scheint.

Cdt1 ist ein zentraler DNA-Replikationsinitiationsfaktor, dessen Spiegel während des Fortschreitens des Zellzyklus oszillieren. Im späten G1 steigen seine Spiegel an, um die DNA-Replikation zu initiieren. Zu Beginn der S-Phase wird es umgehend durch die E3-Ligase abgebaut, so dass Ursprünge, die bereits einmal gefeuert wurden, in der S-Phase nicht erneut feuern und eine erneute Replikation innerhalb eines einzelnen Zellzyklus nicht auftritt. Der beeinträchtigte Abbau von Cdt1 in der S-Phase durch die E3-Ligase ist der Hauptmechanismus, durch den die zelluläre DNA erneut repliziert wird. Es wurde entdeckt, dass in E1A-exprimierenden Zellen die Cdt1-Spiegel in der S-Phase hoch bleiben, was auf einen ineffizienten Abbau von Cdt1 hindeutet, der zu einer umfassenden Replikation der zellulären DNA beitragen könnte, die die Forscher in der späten S-Phase beobachteten.

Das Protein HBO1 (Myst2, KAT7) der Myst-Familie ist eine Histonacetyltransferase, die eine wichtige Rolle bei der Initiierung der Replikation spielt und auch zur DNA-Replikation beiträgt. HBO1 interagiert direkt mit Cdt1 und fungiert als Coaktivator von Cdt1 bei der Initiierung der Replikation. Es assoziiert auch mit dem Replikationsursprung und stimuliert die Ursprungsaktivierung durch Acetylierung von H4 K5, K8 und K12. Die Überexpression von HBO1 induziert eine erneute DNA-Replikation. Die Anreicherung von Chromatinmodifikationen einschließlich der Acetylierung von H4-Histonen an den Ursprüngen beeinflusst stark die Ursprungsaktivierung. Somit zwingt E1A in Abwesenheit einer Vielzahl von Serum-stimulierten Proliferationssignalen die Zellen, unter Verwendung mehrerer kompensatorischer Mechanismen in die S-Phase einzutreten. Ein unkontrolliertes zelluläres DNA-Replikationsprogramm verursacht Polyploidie, die das Kennzeichen von Krebs ist. Es ist aufregend, dass ein virales Onkogen wie E1A das zelluläre DNA-Replikationsprogramm verändert. Dies wirft eine Reihe wichtiger Fragen im Zusammenhang mit dem Mechanismus des durch ein virales Onkogen induzierten Replikationsstresses auf. Wie beispielsweise induziert E1A die DNA-Replikation? Verändert die E1A-Stimulation von HBO1 den Initiationsmechanismus und fördern HBO1-vermittelte Chromatinmodifikationen an den Ursprüngen die Replikation?

SPEZIFISCHES ZIEL DER STUDIE:

Unser spezifisches Ziel ist es zu bestimmen, ob die Stimulierung der HBO1-Aktivität durch E1A eine Rolle bei der deregulierten DNA-Replikation spielt oder nicht, und falls ja, den Mechanismus zu bestimmen.

1. Unter Verwendung von Standardassays werden die Forscher bestimmen, ob E1A an HBO1 bindet, um dessen HAT-Aktivität zu induzieren
2. Unter Verwendung von transienten und Virusinfektionsassays werden die Forscher bestimmen, ob die Stimulierung der HBO1-HAT-Aktivität durch E1A die präreplikative Komplexbildung (Pre-RC) verstärkt und ob die durch E1A induzierte HAT-Aktivität die H4-Acetylierung in den Ursprungsregionen qualitativ und quantitativ verändert.
3. Die Forscher werden feststellen, ob die E1A-Stimulation der HAT-Aktivität von HBO1 zur DNA-Replikation beiträgt.

FORSCHUNGSDESIGN UND METHODEN:

Das Ziel dieser Studie ist es zu bestimmen, ob die Stimulation der HBO1-HAT-Aktivität durch E1A (i) die Initiation verstärkt, (ii) qualitative und quantitative Änderungen der Acetylierung von H4 K5, K8 und K12 in der Ursprungsregion induziert und (iii) die Re- Replikation, die in E1A+-Zellen stattfindet. Wenn eine erhöhte HAT-Aktivität eine oder mehrere dieser Funktionen stimulieren kann, könnte dies erklären, wie diese Eigenschaft von E1A zur Induktion einer aberranten DNA-Replikation beitragen würde.

1. E1A-Bindung an WT- und HAT-defizientes HBO1.

   Die Forscher werden zunächst bestimmen, ob E1A direkt an HBO1 bindet, indem sie die GST-Bindung und in-vivo-Co-IP-Experimente durchführen. Wenn die Bindung bestätigt wird, werden die Forscher die Bindungsstellen auf beiden Proteinen kartieren. Die Forscher werden dann Mutanten beider Proteine ​​isolieren, die die Wechselwirkungen aufheben. Alle E1A-Mutanten werden auf ihre Wechselwirkungen mit Rb und p300 untersucht, und es werden nur Mutanten verwendet, die ihre Fähigkeit zur Bindung an diese Proteine ​​beibehalten. Es wird notwendig sein, eine HBO1-Mutante zu isolieren, die die E1A-Bindungskapazität beibehält, der jedoch die HAT-Aktivität fehlt. In diesen Studien wird eine weit verbreitete HAT-defiziente Mutante G435A verwendet. Wenn E1A an diese Mutante bindet, wird es eine wertvolle Mutante sein, um zu bestätigen, dass die E1A-induzierte HAT-Aktivität kritisch für die Stimulierung der Replikationseinleitung ist. Wenn diese HBO1-Mutante nicht an E1A bindet, ist es wichtig, neue HBO1-Mutanten zu isolieren, die die E1A-Bindungskapazität behalten, aber keine HAT-Aktivität aufweisen.

2. Rolle der E1A-induzierten HBO1-HAT-Aktivität bei der Ursprungsaktivierung:

   Zuerst werden die Ermittler feststellen, ob E1A mit Replikationsursprüngen assoziiert ist und ob diese Assoziation HBO1 erfordert. die Forscher werden den MCM4-Ursprung verwenden, der in der intergenischen Region zwischen PRKDC- und (Proteinkinase, DNA-aktiviertes, katalytisches Polypeptid) und MCM4-Genen kartiert. Zunächst werden die Forscher U2OS-Zellen mit Plasmiden transfizieren, die relevante Proteine ​​exprimieren, und dann ihre Besetzung in Ursprungssequenzen mithilfe von ChIP-Assays bestimmen. Plasmide, die Epitop-markiertes WT-HBO1 oder mutante Derivate exprimieren, zusammen mit Plasmiden, die WT- oder mutante E1A-Proteine ​​exprimieren, werden in U2OS-Zellen exprimiert, dann wird die Besetzung dieser Proteine ​​in Ursprungsregionen gegebenenfalls unter Verwendung von Antikörpern quantifiziert. Typischerweise werden in diesen Experimenten unter Verwendung relevanter Antikörper ChIP-Assays mit Primerpaaren durchgeführt, die Ursprungsregionen und auch Regionen umfassen, die weit vom Ursprung entfernt sind. Die Besetzung von Initiationsfaktoren wird in der Ursprungsregion im Vergleich zu der von 2 KB stromaufwärts oder stromabwärts gelegenen Regionen um ein Vielfaches erhöht. Das Laden des MCM-Komplexes zusammen mit Cdt1 auf die Ursprünge ist ein Hinweis darauf, dass die Initiation der Replikation in diesem Ursprung erfolgt und normalerweise in ChIP-re-ChIP-Assays wie folgt getestet wird: Zuerst wird das Laden von HBO1 in die Ursprünge unter Verwendung von Epitop-spezifischen Antikörpern bestätigt der erste ChIP. Die Anti-HBO1-Präzipitate werden erneut mit Anti-MCM3-Antikörpern gechipt. Das Laden der MCM3-Helikase zu den Ursprüngen erfolgt nach der Cdt1-Bindung und hängt von der HBO1-HAT-Aktivität ab. Normale Mengen an MCM3 werden nach erneutem ChIP-ing in E1A+-Kontrollproben nachgewiesen. Wenn in reChIP-Assays eine reduzierte Menge an MCM3 wiedergefunden wird, wenn die mutierte E1A- oder HBO1-Mutante (z. HBO1 G435A) verwendet wird, würde dies darauf hindeuten, dass die Stimulierung der HAT-Aktivität durch E1A entscheidend für die maximale Ursprungsaktivität in E1A+-Zellen ist. Dieser Assay-Typ, der von anderen erfolgreich verwendet wurde, weist eine beträchtliche Flexibilität dahingehend auf, dass mutante Proteine ​​schnell getestet werden können. Diese ChIP-reChiP-Assays werden in verschiedenen Kombinationen wiederholt, um die E1A-Beladung zu bestimmen.

   Diese Ergebnisse werden auf Virusinfektionsassays ausgeweitet. Durch Arzneimittelbehandlung isolierte G1-spezifische Zellen werden mit Ad-Vektoren infiziert, die gegebenenfalls Epitop-markierte Proteine ​​exprimieren. Die Assoziation von E1A und HBO1 und ihren mutierten Derivaten wird bestimmt. Dieser Assay wird es uns ermöglichen, die Wirkung der durch E1A stimulierten HAT-Aktivität beim Ursprungsfeuer zu bestätigen und die Wirkungen von E1A auf das Ursprungsfeuer zu untersuchen, falls vorhanden, abgesehen von der Erhöhung der HAT-Aktivität von HBO1. Beispielsweise beinhaltet die c-Myc-Induktion durch E1A keine HAT-Aktivität.

3. Wirkungen der E1A-induzierten HBO1-HAT-Aktivität bei der Acetylierung von H4, K5, K8 und K12.

   Um dies zu beurteilen, werden die Ermittler das aus virusinfizierten Zellen hergestellte Chromatin mit den Ursprungs-spezifischen Primern und Epitop-spezifischen Antikörpern ChIPen, um die Ursprungsbeladung von HBO1 nachzuweisen. Die Forscher werden dann die ChIP-Präzipitate mit Anti-H4-Tetra-Ac-Antikörpern erneut chipen, um die K5-, K8- und K12-Acetylierung nachzuweisen. In Zellen, die E1A und HBO1 exprimieren, wird die H4-Acetylierung im Vergleich zu Zellen, die nur mit dem HBO1-Virus infiziert sind, beträchtlich erhöht. Die H4-Acetylierung kann abhängig von den verwendeten Mutanten beeinflusst werden.

4. E1A stimulierte die HBO1-HAT-Aktivität bei der Re-Replikation.

   Es wurde gezeigt, dass die Überexpression von HBO1 die DNA-Replikation induziert. Um festzustellen, ob E1A HBO1 zur Induktion der Re-Replikation durch Stimulierung der HBO1-HAT-Aktivität verwendet, infizieren die Forscher S-Phase-angereicherte Zellen (isoliert durch doppelte Thymidin-Blockierung) mit Ad-Viren, die WT- oder mutierte E1A-Proteine ​​exprimieren, zusammen mit Ad-Vektoren, die HBO1-Varianten exprimieren (z.B. HAT inaktiv), lassen Sie die Infektion nach Bedarf fortschreiten und quantifizieren Sie dann die Zellpopulation mit einem DNA-Gehalt von >4N mit einem Durchflusszytometer. Wenn die E1A-simulierte HBO1-HAT-Aktivität für die erneute Replikation wichtig ist, induzieren HAT-defekte HBO1-Mutanten selbst in Gegenwart von E1A keine erneute Replikation. E1A-Mutanten, die nicht an HBO1 binden können, zeigen ebenfalls einen ähnlichen Phänotyp.

5. E1A-Effekte auf H4-Acetylierungen in replizierenden Ursprüngen:

   Um die H4-Acetylierungen in replizierenden Ursprüngen zu untersuchen, müssen die Forscher wissen, welche der zellulären Ursprünge in E1A+-Zellen in der späten S-Phase repliziert werden. Die Forscher planen, die in E1A+-Zellen aktivierten Ursprünge zu identifizieren, einschließlich derer, die sich erneut replizieren. Sobald die Ermittler einen oder zwei replizierende Ursprünge identifiziert haben, werden die Ermittler die Acetylierungen unter Verwendung dieser Ursprünge in Zellen quantifizieren, die Epitop-markierte WT- und mutierte HBO1-Allele und E1A exprimieren. die Forscher erwarten qualitative oder quantitative (oder beides) bei H4-Acetylierungen aufgrund von E1A.

6. Erwartete Ergebnisse und Fallstricke:

Am Ende aller vorgeschlagenen Experimente erwarten die Forscher festzustellen, ob die Stimulierung der HBO1-HAT-Aktivität durch E1A entscheidend für die Ursprungsaktivierung in E1A+-Zellen ist und ob die E1A-induzierte HAT-Aktivität eine Rolle bei der Replikation spielt. Die Ermittler erwarten keine technischen oder sonstigen Probleme, einschließlich der Beschaffung relevanter Reagenzien.