Adenovirus E1A onkogeenin vaikutus DNA:n replikaatiodynamiikkaan

TAUSTA:

Ihmisen adenoviruksen (Ad) tyypin 2 tai 5 genomin vasemman pään koodaamaa 243 aminohapon E1A-proteiinia (tunnetaan myös pienenä E1A-proteiinina, transformoiva E1A-proteiini) on tutkittu eri yhteyksissä, mukaan lukien mallina yhteistyössä toimiva onkoproteiini, apoptoosi. proteiinia indusoivana ja terapeuttisena onkolyyttisenä proteiinina. Kaikki nämä ominaisuudet liittyvät sen kykyyn indusoida nopeasti S-faasi useissa soluissa. E1A järjestää suurimman osan näistä vaikutuksista olemalla vuorovaikutuksessa useiden kromatiinin uudelleenmuotoilukompleksien kanssa, mukaan lukien Rb-perheen proteiinit ja HAT-proteiinit p300 ja CBP.

E2F:n induktio E1A-Rb-HDAC-vuorovaikutuksilla on hyvin dokumentoitu, kun taas E1A-p300/CBP-vuorovaikutusten seuraukset solusyklin etenemiseen eivät ole selkeitä. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että p300/CBP estää lepotilassa olevien solujen ennenaikaisen pääsyn S-faasiin estämällä c-Myc-transkription kolmiosaisen repressorikompleksin kautta, joka koostuu p300:sta, YY1:stä, HDAC3:sta. E1A sitoutuu p300:aan ja hajottaa repressorikompleksin S-vaiheen indusoimiseksi. c-Mycin induktio tällä mekanismilla edistää DNA-vauriovasteen induktiota ja poikkeavaa solu-DNA-replikaatiota, mikä johtaa genomiseen epävakauteen. Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa osoitettiin, että E1A indusoi keskeisen DNA-replikaation aloitustekijän Cdt1 korkeille tasoille, mikä johtaa lisääntyneeseen replikaation aloitusvaiheeseen ja myöhäisessä S-vaiheessa DNA-vauriovasteen induktioon ja solun DNA:n uudelleenreplikaatioon. Yksimolekyylistä DNA-kuitumääritystä käyttämällä havaittiin, että E1A indusoi merkittäviä muutoksia DNA:n replikaation dynamiikassa ja näyttää indusoivan globaaleja muutoksia alkuperäaktivaatiossa.

Cdt1 on keskeinen DNA:n replikaation aloitustekijä, jonka tasot värähtelevät solusyklin etenemisen aikana. G1:n loppuvaiheessa sen tasot nousevat DNA:n replikaation käynnistämiseksi. S-vaiheen alussa E3-ligaasi hajottaa sen nopeasti, joten kerran jo sytytetyt alkupisteet eivät syty uudelleen S-vaiheessa ja uudelleenreplikaatiota yhden solusyklin sisällä ei tapahdu. E3-ligaasin aiheuttama heikentynyt Cdt1:n hajoaminen S-faasissa on päämekanismi, jolla solun DNA käy läpi uudelleenreplikaation. Havaittiin, että E1A:ta ilmentävissä soluissa Cdt1-tasot pysyvät korkeina S-faasissa, mikä viittaa Cdt1:n tehottomaan hajoamiseen, mikä voi myötävaikuttaa solun DNA:n laajaan replikaatioon, jonka tutkijat havaitsivat myöhäisessä S-vaiheessa.

Myst-perheen proteiini HBO1 (Myst2, KAT7) on histoniasetyylitransferaasi, jolla on tärkeä rooli replikaation aloituksessa ja joka edistää myös DNA:n uudelleenreplikaatiota. HBO1 on suoraan vuorovaikutuksessa Cdt1:n kanssa ja toimii Cdt1:n koaktivaattorina replikaation aloituksessa. Se liittyy myös replikaation aloituskohtaan ja stimuloi aloituskohdan aktivaatiota asetyloimalla H4 K5, K8 ja K12. HBO1:n yli-ilmentyminen indusoi DNA:n uudelleenreplikaation. Kromatiinimodifikaatioiden rikastaminen, mukaan lukien H4-histonien asetylaatio origoissa, vaikuttaa voimakkaasti alkuperän aktivaatioon. Siten E1A pakottaa solut siirtymään S-vaiheeseen useiden kompensaatiomekanismien avulla ilman seerumin stimuloimia proliferaatiosignaaleja. Hallitsematon solujen DNA:n replikaatio-ohjelma aiheuttaa polyploidia, joka on syövän tunnusmerkki. On jännittävää, että viruksen onkogeeni, kuten E1A, muuttaa solun DNA:n replikaatioohjelmaa. Tämä herättää useita tärkeitä kysymyksiä, jotka liittyvät viruksen onkogeenin aiheuttamaan replikaatiostressin mekanismiin. Esimerkiksi kuinka E1A indusoi DNA:n uudelleenreplikaation? Muuttaako HBO1:n E1A-stimulaatio aloitusmekanismia ja edistävätkö HBO1-välitteiset kromatiinimuunnokset alkupisteissä uudelleenreplikaatiota?

TUTKIMUKSEN ERITYISTAVOITE:

Erityinen tavoitteemme on määrittää, onko HBO1-aktiivisuuden stimulaatiolla E1A:n vaikutusta säätelemättömään DNA-replikaatioon, ja jos on, määrittää mekanismi.

1. Standardimäärityksiä käyttämällä tutkijat määrittävät, sitoutuuko E1A HBO1:een indusoidakseen sen HAT-aktiivisuutta
2. Ohimeneviä ja virusinfektiomäärityksiä käyttämällä tutkijat määrittävät, tehostaako HBO1 HAT -aktiivisuuden stimulointi E1A:lla prereplikatiivisen kompleksin (Pre-RC) muodostumista ja muuttaako E1A:n aiheuttama HAT-aktiivisuus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti H4-asetylaatiota lähtöalueilla.
3. tutkijat määrittävät, edistääkö HBO1:n HAT-aktiivisuuden E1A-stimulaatio DNA:n uudelleenreplikaatiota.

TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU JA MENETELMÄT:

Tämän tutkimuksen tavoitteena on määrittää, tehostaako HBO1 HAT -aktiivisuuden stimulaatio E1A:lla (i) initiaatiota (ii) aiheuttaako kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia muutoksia H4 K5:n, K8:n ja K12:n asetylaatiossa lähtöalueella ja (iii) tehostaako uudelleen replikaatio, joka tapahtuu E1A+ -soluissa. Jos lisääntynyt HAT-aktiivisuus voi stimuloida yhtä tai useampaa näistä toiminnoista, se voisi selittää, kuinka tämä E1A:n ominaisuus myötävaikuttaisi poikkeavan DNA:n replikaation induktioon.

1. E1A sitoutuu WT- ja HAT-puutteiseen HBO1:een.

   tutkijat määrittävät ensin, sitoutuuko E1A suoraan HBO1:een suorittamalla GST-sitoutumis- ja in vivo -ko-IP-kokeet. Jos sitoutuminen vahvistetaan, tutkijat kartoittavat molempien proteiinien sitoutumiskohdat. sitten tutkijat eristävät molempien proteiinien mutantit, jotka kumoavat vuorovaikutuksen. Kaikki E1A-mutantit arvioidaan niiden vuorovaikutusten suhteen Rb:n ja p300:n kanssa, ja vain sellaisia ​​mutantteja, jotka säilyttävät kykynsä sitoutua näihin proteiineihin, käytetään. On tarpeen eristää HBO1-mutantti, joka säilyttää E1A:n sitoutumiskapasiteetin, mutta josta puuttuu HAT-aktiivisuus. Näissä tutkimuksissa käytetään laajasti käytettyä HAT-puutteista G435A-mutanttia. Jos E1A sitoutuu tähän mutanttiin, se on arvokas mutantti vahvistamaan, että E1A:n indusoima HAT-aktiivisuus on kriittistä replikaation aloituksen stimuloinnissa. Jos tämä HBO1-mutantti ei sitoudu E1A:han, on tärkeää eristää uudet HBO1-mutantit, jotka säilyttävät E1A:n sitoutumiskapasiteetin, mutta joilla ei ole HAT-aktiivisuutta.

2. E1A:n indusoiman HBO1 HAT -aktiivisuuden rooli alkuperäaktivaatiossa:

   Ensin tutkijat määrittävät, liittyykö E1A replikaation aloituskohtiin ja vaatiiko tämä assosiaatio HBO1:tä. tutkijat käyttävät MCM4-alkuperää, joka kartoittaa geenien välisellä alueella PRKDC:n ja (proteiinikinaasi, DNA-aktivoitu, katalyyttinen polypeptidi) ja MCM4-geenien välillä. Ensin tutkijat transfektoivat U2OS-solut relevantteja proteiineja ilmentävillä plasmideilla ja määrittävät sitten niiden läsnäolon alkuperäsekvensseissä käyttämällä ChIP-määrityksiä. Plasmidit, jotka ilmentävät epitooppimerkittyä WT HBO1:tä tai mutanttijohdannaisia ​​yhdessä plasmidien kanssa, jotka ekspressoivat WT- tai mutantti-E1A-proteiineja, ekspressoidaan U2OS-soluissa, minkä jälkeen näiden proteiinien läsnäolo alkuperäalueilla kvantifioidaan käyttämällä vasta-aineita tarpeen mukaan. Tyypillisesti näissä kokeissa, käyttäen relevantteja vasta-aineita, ChIP-määritykset suoritetaan alukepareilla, jotka kattavat alkuperäalueet ja myös alueet, jotka ovat kaukana alkuperästä. Alkutekijöiden käyttöaste lisääntyy useita kertoja lähtöalueella verrattuna 2KB ylä- tai alavirtaan oleviin alueisiin. MCM-kompleksin lataaminen Cdt1:n kanssa alkupisteisiin on osoitus siitä, että replikaation aloitus tapahtuu kyseisessä origossa, ja se analysoidaan yleensä ChIP-re-ChIP-määrityksissä seuraavasti: Ensinnäkin, HBO1:n lataaminen alkupisteisiin varmistetaan käyttämällä epitooppispesifisiä vasta-aineita ensimmäinen ChIP. Anti-HBO1-saostumat Chipoidaan uudelleen anti-MCM3-vasta-aineilla. MCM3-helikaasin lataaminen alkupisteisiin tapahtuu Cdt1:n sitoutumisen jälkeen ja riippuu HBO1 HAT -aktiivisuudesta. Normaalit määrät MCM3:a havaitaan uudelleen ChIP-käsittelyn jälkeen E1A+ -kontrollinäytteissä. Jos pienempi määrä MCM3:a saadaan talteen reChIP-määrityksissä, kun mutantti E1A- tai HBO1-mutantti (esim. HBO1 G435A) käytetään, se osoittaisi, että HAT-aktiivisuuden stimulointi E1A:lla on kriittistä maksimaaliselle alkuperäaktiivisuudelle E1A+-soluissa. Tämän tyyppisellä määrityksellä, jota muut ovat menestyksekkäästi käyttäneet, on huomattavaa joustavuutta siinä mielessä, että mutanttiproteiinit voidaan määrittää nopeasti. Nämä ChIP-reChiP-määritykset toistetaan eri yhdistelminä E1A-kuormituksen määrittämiseksi.

   Nämä tulokset laajennetaan virusinfektiomäärityksiin. Lääkekäsittelyllä eristetyt G1-spesifiset solut infektoidaan Ad-vektoreilla, jotka ekspressoivat epitooppimerkittyjä proteiineja tarpeen mukaan. E1A:n ja HBO1:n ja niiden mutanttijohdannaisten assosiaatio määritetään. Tämän määrityksen avulla voimme vahvistaa E1A:n stimuloiman HAT-aktiivisuuden vaikutuksen alkulähteessä ja tutkia E1A:n vaikutuksia alkulähteeseen, jos sellaisia ​​on, paitsi HBO1:n HAT-aktiivisuuden lisäämisessä. Esimerkiksi E1A:n c-Myc-induktio ei sisällä HAT-aktiivisuutta.

3. E1A:n indusoiman HBO1 HAT -aktiivisuuden vaikutukset H4:n, K5:n, K8:n ja K12:n asetylaatiossa.

   Tämän arvioimiseksi tutkijat analysoivat viruksen infektoimista soluista valmistetun kromatiinin alkuperäspesifisillä alukkeilla ja epitooppispesifisillä vasta-aineilla tarpeen mukaan HBO1:n alkuperälatauksen havaitsemiseksi. tutkijat sirpaloivat sitten uudelleen ChIP-saostumat käyttämällä anti-H4-tetra-Ac-vasta-aineita K5-, K8- ja K12-asetylaation havaitsemiseksi. Soluissa, jotka ilmentävät E1A:ta ja HBO1:tä, H4-asetylaatio lisääntyy huomattavasti verrattuna soluihin, jotka on infektoitu pelkällä HBO1-viruksella. H4-asetylaatio voi vaikuttaa käytetyistä mutanteista riippuen.

4. E1A stimuloi HBO1 HAT -aktiivisuutta uudelleenreplikaatiossa.

   HBO1:n yli-ilmentymisen on osoitettu indusoivan DNA:n replikaatiota. Sen määrittämiseksi, käyttääkö E1A HBO1:tä uudelleenreplikaation indusoimiseen stimuloimalla HBO1 HAT -aktiivisuutta, tutkijat infektoivat S-vaiheessa rikastetut solut (eristetty kaksoistymidiiniblokilla) Ad-viruksilla, jotka ekspressoivat WT- tai mutantti-E1A-proteiineja sekä Ad-vektoreita, jotka ilmentävät HBO1-variantteja. (esim. HAT inactive), anna infektion edetä tarpeen mukaan ja määritä sitten >4N DNA-pitoisuutta sisältävien solujen populaatio virtaussytometrillä. Jos E1A-simuloitu HBO1-HAT-aktiivisuus on tärkeää uudelleenreplikaatiolle, vialliset HBO1-mutantit eivät indusoi uudelleenreplikaatiota edes E1A:n läsnä ollessa. E1A-mutantit, jotka eivät voi sitoutua HBO1:een, osoittavat myös samanlaista fenotyyppiä.

5. E1A:n vaikutukset H4-asetylaatioihin replikoitumisalkuperäissä:

   H4-asetylaatioiden tutkimiseksi uudelleenreplikoituvissa aloissa tutkijoiden on tiedettävä, mitkä solujen alkuperästä replikoituvat uudelleen E1A+ -soluissa myöhäisessä S-vaiheessa. tutkijat suunnittelevat tunnistavansa E1A+ -soluissa aktivoidut alkuperät, mukaan lukien ne, jotka replikoituvat uudelleen. Kun tutkijat tunnistavat yhden tai kaksi replikoituvaa alkuperää, tutkijat määrittävät asetylaatiot kvantitatiivisesti käyttämällä näitä lähtökohtia soluissa, jotka ilmentävät epitooppimerkittyjä WT- ja mutantti-HBO1-alleeleja ja E1A:ta. tutkijat odottavat kvalitatiivisia tai kvantitatiivisia (tai molempia) E1A:n aiheuttamissa H4-asetylaatioissa.

6. Odotetut tulokset ja sudenkuopat:

Kaikkien ehdotettujen kokeiden lopussa tutkijat odottavat määrittävänsä, onko HBO1 HAT -aktiivisuuden stimulaatio E1A:lla kriittistä E1A+ -solujen alkupensaaktivaatiolle ja onko E1A:n aiheuttamalla HAT-aktiivisuudella roolia uudelleenreplikaatiossa. Tutkijat eivät ennakoi teknisiä tai muita ongelmia, mukaan lukien asiaankuuluvien reagenssien saaminen.