Adenovirus E1A Oncogene이 DNA 복제 역학에 미치는 영향

배경:

인간 아데노바이러스(Ad) 유형 2 또는 5 게놈의 왼쪽 말단에 의해 코딩되는 243개 아미노산 E1A 단백질(작은 E1A 단백질, 변형 E1A 단백질이라고도 함)은 모델 협력 종양 단백질, 세포사멸을 포함하여 다양한 맥락에서 연구되었습니다. 유도 단백질 및 치료 종양 용해성 단백질. 이러한 모든 특성은 다양한 세포에서 S기를 빠르게 유도하는 능력과 관련이 있습니다. E1A는 Rb 계열 단백질, HAT 단백질 p300 및 CBP를 포함한 일련의 염색질 리모델링 복합체와 상호 작용하여 이러한 효과의 대부분을 조율합니다.

E1A-Rb-HDAC 상호작용에 의한 E2F의 유도는 잘 문서화되어 있는 반면, 세포 주기 진행에서 E1A-p300/CBP 상호작용의 결과는 명확하지 않습니다. 이전 연구에서는 p300/CBP가 p300, YY1, HDAC3로 구성된 3자 억제 복합체를 통해 c-Myc 전사를 억제하여 휴지기 세포가 S기에 조기 진입하는 것을 방지한다는 것을 입증했습니다. E1A는 p300에 결합하고 리프레서 복합체를 분리하여 S기를 유도합니다. 이 메커니즘에 의한 c-Myc의 유도는 DNA 손상 반응의 유도 및 비정상적인 세포 DNA 복제에 기여하여 게놈 불안정성을 초래합니다. 최근에 발표된 연구에서 E1A는 중추적인 DNA 복제 개시 인자 Cdt1을 높은 수준으로 유도하여 복제 시작 활동을 증가시키고 후기 S기에서 DNA 손상 반응 및 세포 DNA 재복제를 유도하는 것으로 나타났습니다. 단일 분자 DNA 섬유 분석을 사용하여 E1A가 DNA 복제 역학에 상당한 변화를 유도하고 오리진 활성화의 전반적인 변화를 유도하는 것으로 나타났습니다.

Cdt1은 세포 주기가 진행되는 동안 수준이 진동하는 중추적인 DNA 복제 개시 인자입니다. 후기 G1에서 그 수준이 상승하여 DNA 복제를 시작합니다. S기가 시작되면 E3 리가제에 의해 즉시 분해되어 이미 한 번 발화한 기원이 S기에 다시 발화하지 않고 단일 세포 주기 내에서 재복제가 일어나지 않습니다. E3 리가제에 의한 S기의 Cdt1의 손상된 분해는 세포 DNA가 재복제되는 주요 메커니즘입니다. E1A 발현 세포에서 Cdt1 수준은 S기에 높게 유지되어 연구자들이 후기 S기에 관찰한 세포 DNA의 광범위한 재복제에 기여할 수 있는 Cdt1의 비효율적인 분해를 암시하는 것으로 밝혀졌습니다.

Myst 계열 단백질 HBO1(Myst2, KAT7)은 복제 개시에서 중요한 역할을 하고 DNA 재복제에도 기여하는 히스톤 아세틸 전이효소입니다. HBO1은 Cdt1과 직접 상호 작용하고 복제 개시에서 Cdt1의 공동 활성화제 역할을 합니다. 또한 H4 K5, K8 및 K12를 아세틸화하여 복제 기점과 연결하고 기점 활성화를 자극합니다. HBO1의 과발현은 DNA 재복제를 유도합니다. 기원에서 H4 히스톤의 아세틸화를 포함하는 염색질 변형의 농축은 기원 활성화에 강하게 영향을 미칩니다. 따라서, 다수의 혈청 자극 증식 신호가 없는 E1A는 여러 보상 메커니즘을 사용하여 세포가 S기에 진입하도록 합니다. 제어되지 않은 세포 DNA 복제 프로그램은 암의 특징인 배수성을 유발합니다. E1A와 같은 바이러스성 종양 유전자가 세포 DNA 복제 프로그램을 변경한다는 것은 흥미로운 일입니다. 이것은 바이러스 종양유전자에 의해 유도된 복제 스트레스의 메커니즘과 관련된 많은 중요한 질문을 제기합니다. 예를 들어, E1A는 어떻게 DNA 재복제를 유도합니까? HBO1의 E1A 자극이 개시 메커니즘을 변경하고 기원에서 HBO1 매개 염색질 변형이 재복제를 촉진하는지 여부를 변경합니까?

연구의 구체적인 목적:

우리의 특정 목표는 E1A에 의한 HBO1 활동의 자극이 규제 완화된 DNA 복제에 역할을 하는지 여부를 결정하고, 만약 그렇다면 메커니즘을 결정하는 것입니다.

1. 표준 분석을 사용하여 조사관은 E1A가 HBO1에 결합하여 HAT 활성을 유도하는지 여부를 결정할 것입니다.
2. 일시적 및 바이러스 감염 분석을 사용하여 조사자는 E1A에 의한 HBO1 HAT 활동의 자극이 사전 복제 복합체(Pre-RC) 형성을 강화하는지 여부와 E1A 유도 HAT 활동이 기원 영역에서 H4 아세틸화를 질적 및 양적으로 변화시키는지 여부를 결정할 것입니다.
3. 조사관은 HBO1의 HAT 활동의 E1A 자극이 DNA 재복제에 기여하는지 여부를 결정할 것입니다.

연구 설계 및 방법:

이 연구의 목표는 E1A에 의한 HBO1 HAT 활성의 자극이 (i) 개시를 강화하는지 (ii) 오리진 영역에서 H4 K5, K8 및 K12의 아세틸화에서 질적 및 양적 변화를 유도하는지, (iii) 재형성을 강화하는지 여부를 결정하는 것입니다. E1A+ 세포에서 일어나는 복제. 증가된 HAT 활동이 이러한 기능 중 하나 이상을 자극할 수 있다면 E1A의 이러한 특성이 비정상적인 DNA 복제 유도에 어떻게 기여하는지 설명할 수 있습니다.

1. WT 및 HAT 결핍 HBO1에 결합하는 E1A.

   조사관은 먼저 GST 결합 및 생체 내 co-IP 실험을 수행하여 E1A가 HBO1에 직접 결합하는지 여부를 결정할 것입니다. 결합이 확인되면 조사관은 두 단백질의 결합 부위를 매핑합니다. 그런 다음 연구자들은 상호 작용을 없애는 두 단백질의 돌연변이를 분리합니다. 모든 E1A 돌연변이는 Rb 및 p300과의 상호 작용에 대해 평가되며 이러한 단백질에 결합할 수 있는 능력을 유지하는 돌연변이만 사용됩니다. E1A 결합 능력을 유지하지만 HAT 활성이 부족한 HBO1 돌연변이를 분리하는 것이 필요할 것입니다. 널리 사용되는 HAT 결핍 돌연변이 G435A가 이러한 연구에 사용될 것입니다. E1A가 이 돌연변이에 결합한다면 E1A 유도 HAT 활성이 복제 개시 자극에 중요하다는 것을 확인하는 것은 귀중한 돌연변이가 될 것입니다. 이 HBO1 돌연변이가 E1A에 결합하지 않으면 E1A 결합 능력은 유지하지만 HAT 활성이 부족한 새로운 HBO1 돌연변이를 분리하는 것이 중요합니다.

2. 오리진 활성화에서 E1A 유도 HBO1 HAT 활성의 역할:

   먼저 조사관은 E1A가 복제 원본과 연결되는지 여부와 이 연결에 HBO1이 필요한지 여부를 결정합니다. 연구자들은 PRKDC와 (Protein Kinase, DNA-Activated, Catalytic Polypeptide) 및 MCM4 유전자 사이의 유전자간 영역에 매핑되는 MCM4 기원을 사용할 것입니다. 먼저 조사관은 관련 단백질을 발현하는 플라스미드로 U2OS 세포를 형질 감염시킨 다음 ChIP 분석을 사용하여 기원 서열에서 점유율을 결정할 것입니다. WT 또는 돌연변이 E1A 단백질을 발현하는 플라스미드와 함께 에피토프 태그 WT HBO1 또는 돌연변이 유도체를 발현하는 플라스미드는 U2OS 세포에서 발현될 것이며, 기원 영역에서 이들 단백질의 점유는 적절한 항체를 사용하여 정량화될 것이다. 일반적으로 이러한 실험에서 관련 항체를 사용하여 ChIP 분석은 기원 영역과 기원에서 멀리 떨어진 영역을 포함하는 프라이머 쌍으로 수행됩니다. 개시 인자의 점유는 2KB 업스트림 또는 다운스트림 영역과 비교하여 오리진 영역에서 몇 배 증가합니다. 오리진에 Cdt1과 함께 MCM 복합체를 로딩하는 것은 복제 개시가 해당 오리진에서 발생하고 일반적으로 다음과 같이 ChIP-re-ChIP 분석에서 분석된다는 표시입니다. 첫 번째 칩. 항-HBO1 침전물은 항-MCM3 항체로 재칩될 것입니다. 기원에 대한 MCM3 헬리카제의 로딩은 Cdt1 결합 후에 발생하며 HBO1 HAT 활동에 따라 달라집니다. 정상적인 양의 MCM3은 E1A+ 제어 샘플에서 재칩 후 감지됩니다. 돌연변이 E1A 또는 HBO1 돌연변이(예: HBO1 G435A)가 사용되면 E1A에 의한 HAT 활성의 자극이 E1A+ 세포에서 최대 기원 활성에 중요하다는 것을 나타냅니다. 다른 사람에 의해 성공적으로 사용된 이러한 유형의 분석은 돌연변이 단백질을 신속하게 분석할 수 있다는 점에서 상당한 유연성을 가지고 있습니다. 이 ChIP-reChiP 분석은 E1A 로딩을 결정하기 위해 다양한 조합으로 반복됩니다.

   이 결과는 바이러스 감염 분석으로 확장됩니다. 약물 처리에 의해 분리된 G1 특이적 세포는 적절하게 에피토프 태그 단백질을 발현하는 Ad 벡터로 감염될 것입니다. E1A와 HBO1의 연관성 및 이들의 돌연변이 유도체가 결정될 것이다. 이 분석을 통해 오리진 발화에서 E1A 자극 HAT 활동의 효과를 확인하고 HBO1의 HAT 활동을 증가시키는 것 외에 오리진 발화에 대한 E1A의 영향을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, E1A에 의한 c-Myc 유도에는 HAT 활동이 포함되지 않습니다.

3. H4, K5, K8 및 K12의 아세틸화에서 E1A 유도 HBO1 HAT 활성의 효과.

   이를 평가하기 위해 조사관은 HBO1의 기원 로딩을 감지하기 위해 적절한 기원 특정 프라이머 및 에피토프 특정 항체를 사용하여 바이러스 감염 세포에서 준비된 염색질을 ChIP합니다. 조사관은 K5, K8 및 K12 아세틸화를 검출하기 위해 항-H4 테트라-Ac 항체를 사용하여 ChIP 침전물을 재칩핑합니다. E1A 및 HBO1을 발현하는 세포에서, H4 아세틸화는 HBO1 바이러스 단독으로 감염된 세포에 비해 상당히 증가할 것이다. H4 아세틸화는 사용된 돌연변이에 따라 영향을 받을 수 있습니다.

4. E1A는 재복제에서 HBO1 HAT 활동을 자극했습니다.

   HBO1의 과발현은 DNA 복제를 유도하는 것으로 나타났습니다. E1A가 HBO1 HAT 활성을 자극하여 재복제를 유도하는 데 HBO1을 사용하는지 여부를 확인하기 위해 연구자는 HBO1 변이체를 발현하는 Ad 벡터와 함께 야생형 또는 돌연변이 E1A 단백질을 발현하는 Ad 바이러스로 S기 농축 세포(이중 티미딘 블록으로 분리)를 감염시킬 것입니다. (예. HAT 비활성), 필요에 따라 감염이 진행되도록 한 다음 유세포 분석기를 사용하여 >4N DNA 함량을 포함하는 세포 집단을 정량화합니다. E1A 모의 HBO1 HAT 활동이 재복제에 중요한 경우 HAT 결함이 있는 HBO1 돌연변이는 E1A가 있는 경우에도 재복제를 유도하지 않습니다. HBO1에 결합할 수 없는 E1A 돌연변이도 비슷한 표현형을 보일 것입니다.

5. 재복제 기원에서 H4 아세틸화에 대한 E1A 효과:

   재복제 기원에서 H4 아세틸화를 연구하기 위해 연구자들은 후기 S기에 있는 E1A+ 세포에서 재복제를 겪는 세포 기원을 알아야 합니다. 연구자들은 재복제를 포함하여 E1A+ 세포에서 활성화된 기원을 식별할 계획입니다. 조사관이 하나 또는 두 개의 재복제 기원을 확인하면, 조사관은 에피토프 태그 WT 및 돌연변이 HBO1 대립유전자 및 E1A를 발현하는 세포에서 이러한 기원을 사용하여 아세틸화를 정량화합니다. 연구자들은 E1A로 인한 H4 아세틸화에서 정성적 또는 정량적(또는 둘 다)을 예상합니다.

6. 예상 결과 및 함정:

제안된 모든 실험의 끝에서 연구자들은 E1A에 의한 HBO1 HAT 활성의 자극이 E1A+ 세포의 기원 활성화에 중요한지 여부와 E1A 유도 HAT 활성이 재복제에서 역할을 하는지를 결정할 것으로 기대합니다. 조사관은 관련 시약 확보를 포함하여 기술적 또는 기타 문제를 예상하지 않습니다.