腺病毒 E1A 癌基因对 DNA 复制动力学的影响

背景：

由人类腺病毒 (Ad) 2 型或 5 型基因组左端编码的 243 个氨基酸的 E1A 蛋白（也称为小 E1A 蛋白，转化 E1A 蛋白）已在各种背景下进行了研究，包括作为协同癌蛋白的模型，细胞凋亡诱导蛋白，并作为治疗性溶瘤蛋白。 所有这些特性都与其在各种细胞中快速诱导 S 期的能力有关。 E1A 通过与一系列染色质重塑复合物（包括 Rb 家族蛋白以及 HAT 蛋白 p300 和 CBP）相互作用来协调大部分这些效应。

E1A-Rb-HDAC 相互作用对 E2F 的诱导有据可查，而 E1A-p300/CBP 相互作用在细胞周期进程中的后果尚不清楚。 先前的研究表明，p300/CBP 通过由 p300、YY1、HDAC3 组成的三联抑制复合物抑制 c-Myc 转录，从而防止静止细胞过早进入 S 期。 E1A 与 p300 结合并解离阻遏物复合物以诱导 S 期。 通过这种机制诱导 c-Myc 有助于诱导 DNA 损伤反应和异常细胞 DNA 复制，从而导致基因组不稳定。 在最近发表的一项研究中，表明 E1A 将关键的 DNA 复制起始因子 Cdt1 诱导到高水平，导致复制起点活性增加，并在晚期 S 期诱导 DNA 损伤反应和细胞 DNA 再复制。 使用单分子 DNA 纤维测定，发现 E1A 会引起 DNA 复制动力学的显着变化，并且似乎会引起起源激活的全局变化。

Cdt1 是一种关键的 DNA 复制起始因子，其水平在细胞周期进程中波动。 在 G1 晚期，其水平升高以启动 DNA 复制。 在 S 期开始时，它会被 E3 连接酶迅速降解，因此已经发射一次的起源不会在 S 期再次发射，并且不会在单个细胞周期内发生重新复制。 E3 连接酶对 S 期 Cdt1 的降解受损是细胞 DNA 进行再复制的主要机制。 发现在 E1A 表达细胞中，Cdt1 水平在 S 期仍然很高，这表明 Cdt1 的降解效率低下，这可能导致研究人员在晚期 S 期观察到的细胞 DNA 的广泛再复制。

Myst 家族蛋白 HBO1（Myst2、KAT7）是一种组蛋白乙酰转移酶，在复制启动中起主要作用，也有助于 DNA 再复制。 HBO1 直接与 Cdt1 相互作用，并在复制启动中充当 Cdt1 的共激活因子。 它还与复制起点相关联，并通过乙酰化 H4、K5、K8 和 K12 来刺激复制起点激活。 HBO1 的过表达诱导 DNA 再复制。 染色质修饰的富集，包括起源处 H4 组蛋白的乙酰化，强烈影响起源激活。 因此，在没有大量血清刺激增殖信号的情况下，E1A 使用几种补偿机制迫使细胞进入 S 期。 不受控制的细胞 DNA 复制程序会导致多倍体，这是癌症的标志。 令人兴奋的是，E1A 等病毒致癌基因改变了细胞 DNA 复制程序。 这提出了许多与病毒致癌基因诱导的复制应激机制相关的重要问题。 例如，E1A 是如何诱导 DNA 重新复制的？ E1A 刺激 HBO1 是否会改变起始机制以及 HBO1 介导的染色质修饰是否会促进再复制？

研究的具体目的：

我们的具体目标是确定 E1A 对 HBO1 活性的刺激是否在解除管制的 DNA 复制中发挥作用，如果是，则确定其机制。

1. 使用标准测定法，研究人员将确定 E1A 是否与 HBO1 结合以诱导其 HAT 活性
2. 使用瞬时和病毒感染测定，研究人员将确定 E1A 对 HBO1 HAT 活性的刺激是否会增强复制前复合体 (Pre-RC) 的形成，以及 E1A 诱导的 HAT 活性是否会定性和定量地改变起始区域的 H4 乙酰化。
3. 研究人员将确定 E1A 刺激 HBO1 的 HAT 活性是否有助于 DNA 再复制。

研究设计和方法：

本研究的目的是确定 E1A 对 HBO1 HAT 活性的刺激是否 (i) 增强启动 (ii) 在起始区域诱导 H4 K5、K8 和 K12 乙酰化的定性和定量变化，以及 (iii) 增强再- E1A+ 细胞中发生的复制。 如果增加的 HAT 活性可以刺激这些功能中的一种或多种，​​则可以解释 E1A 的这种特性如何有助于诱导异常 DNA 复制。

1. E1A 与 WT 和 HAT 缺陷型 HBO1 结合。

   研究人员将首先通过进行 GST 结合和体内 co-IP 实验来确定 E1A 是否直接与 HBO1 结合。 如果确认结合，研究人员将绘制两种蛋白质上的结合位点。 然后，研究人员将分离出两种蛋白质的突变体，从而消除相互作用。 将评估所有 E1A 突变体与 Rb 和 p300 的相互作用，并且仅使用保留其与这些蛋白质结合能力的突变体。 有必要分离保留 E1A 结合能力但缺乏 HAT 活性的 HBO1 突变体。 广泛使用的 HAT 缺陷突变体 G435A 将用于这些研究。 如果 E1A 与该突变体结合，它将是一个有价值的突变体，可以确认 E1A 诱导的 HAT 活性对于刺激复制起始至关重要。 如果此 HBO1 突变体不与 E1A 结合，则分离保留 E1A 结合能力但缺乏 HAT 活性的新 HBO1 突变体将很重要。

2. E1A 诱导 HBO1 HAT 活性在原点激活中的作用：

   首先，研究人员将确定 E1A 是否与复制起点相关联，以及这种关联是否需要 HBO1。研究人员将使用 MCM4 起源，它映射在 PRKDC 和（蛋白激酶、DNA 激活、催化多肽）和 MCM4 基因之间的基因间区域。 首先，研究人员将用表达相关蛋白质的质粒转染 U2OS 细胞，然后使用 ChIP 测定法确定它们在原始序列中的占有率。 表达表位标记的 WT HBO1 或突变衍生物的质粒以及表达 WT 或突变 E1A 蛋白的质粒将在 U2OS 细胞中表达，然后使用适当的抗体量化这些蛋白在起源区域的占有率。 通常在这些实验中，使用相关抗体，使用包含起源区域和远离起源区域的引物对进行 ChIP 测定。 与 2KB 上游或下游区域相比，起始因子的占用率在起始区域增加了数倍。 将 MCM 复合物与 Cdt1 一起加载到原点表明复制起始发生在该原点，通常在 ChIP-re-ChIP 分析中进行如下测定：首先，使用表位特异性抗体确认 HBO1 到原点的加载第一个芯片。 抗 HBO1 沉淀物将用抗 MCM3 抗体重新芯片化。 MCM3 解旋酶加载到原点发生在 Cdt1 结合之后，并且取决于 HBO1 HAT 活性。 在 E1A+ 对照样品中重新 ChIP 后，将检测到正常量的 MCM3。 如果在突变体 E1A 或 HBO1 突变体（例如 使用 HBO1 G435A)，这表明 E1A 对 HAT 活性的刺激对于 E1A+ 细胞中的最大起源活性至关重要。 这种已被其他人成功使用的检测方法具有相当大的灵活性，可以快速检测突变蛋白。 这种 ChIP-reChiP 测定将以不同的组合重复以确定 E1A 加载。

   这些结果将扩展到病毒感染检测。 通过药物处理分离的 G1 特异性细胞将酌情用表达表位标记蛋白的 Ad 载体感染。 将确定 E1A 和 HBO1 及其突变衍生物的关联。 该测定将使我们能够确认 E1A 刺激的 HAT 活动对起源射击的影响，并研究 E1A 对起源射击的影响（如果有的话），而不是增加 HBO1 的 HAT 活动。 例如，E1A 诱导的 c-Myc 不涉及 HAT 活动。

3. E1A 诱导 HBO1 HAT 活性对 H4、K5、K8 和 K12 乙酰化的影响。

   为对此进行评估，研究人员将使用起源特异性引物和表位特异性抗体对从病毒感染细胞制备的染色质进行 ChIP，以检测 HBO1 的起源加载。然后，研究人员将使用抗 H4 tetra-Ac 抗体对 ChIP 沉淀物进行重新芯片化，以检测 K5、K8 和 K12 乙酰化。 在表达 E1A 和 HBO1 的细胞中，与单独感染 HBO1 病毒的细胞相比，H4 乙酰化将大大增加。 H4 乙酰化可能会受到影响，具体取决于所使用的突变体。

4. E1A 在再复制中刺激 HBO1 HAT 活动。

   HBO1 的过表达已被证明可诱导 DNA 复制。 为了确定 E1A 是否使用 HBO1 通过刺激 HBO1 HAT 活性来诱导再复制，研究人员将用表达 WT 或突变 E1A 蛋白的 Ad 病毒以及表达 HBO1 变体的 Ad 载体感染 S 期富集细胞（通过双胸苷阻断分离） （例如。 HAT 不活动），允许感染根据需要进行，然后使用流式细胞仪量化含有 > 4N DNA 含量的细胞群。 如果 E1A 模拟的 HBO1 HAT 活性对于再复制很重要，那么即使存在 E1A，HAT 缺陷型 HBO1 突变体也不会诱导再复制。 不能与 HBO1 结合的 E1A 突变体也会表现出类似的表型。

5. E1A 对重新复制起源中 H4 乙酰化的影响：

   为了研究再复制起源中的 H4 乙酰化，研究人员需要知道哪些细胞起源在 E1A+ 细胞的晚期 S 期进行再复制。 研究人员正计划确定在 E1A+ 细胞中激活的起源，包括那些重新复制的细胞。 一旦研究人员确定了一个或两个重新复制的起源，研究人员将使用这些起源在表达表位标记的 WT 和突变 HBO1 等位基因和 E1A 的细胞中量化乙酰化。研究人员预计 E1A 导致的 H4 乙酰化会发生定性或定量（或两者）。

6. 预期结果和陷阱：

在所有提议的实验结束时，研究人员希望确定 E1A 对 HBO1 HAT 活性的刺激是否对 E1A+ 细胞的起源激活至关重要，以及 E1A 诱导的 HAT 活性是否在再复制中起作用。 研究人员预计不会出现任何技术或其他问题，包括获取相关试剂。