Effect van Adenovirus E1A-oncogen op DNA-replicatiedynamiek

ACHTERGROND:

Het E1A-eiwit van 243 aminozuren (ook bekend als klein E1A-eiwit, transformerend E1A-eiwit) dat wordt gecodeerd door het linkeruiteinde van het genoom van het menselijke adenovirus (Ad) type 2 of 5 is in verschillende contexten bestudeerd, waaronder als een model dat samenwerkt met oncoproteïne, een apoptose inducerend eiwit, en als een therapeutisch oncolytisch eiwit. Al deze eigenschappen houden verband met het vermogen om snel de S-fase in een verscheidenheid aan cellen te induceren. E1A orkestreert de meeste van deze effecten door interactie met een reeks chromatine-hermodelleringscomplexen, waaronder de Rb-familie-eiwitten en de HAT-eiwitten p300 en CBP.

De inductie van E2F door E1A-Rb-HDAC-interacties is goed gedocumenteerd, terwijl de gevolgen van E1A-p300/CBP-interacties op de voortgang van de celcyclus niet duidelijk zijn. Eerdere studies toonden aan dat p300/CBP voortijdige binnenkomst van rustende cellen in de S-fase voorkomt door c-Myc-transcriptie te onderdrukken via een tripartiet repressorcomplex bestaande uit p300, YY1, HDAC3. E1A bindt zich aan p300 en dissocieert het repressorcomplex om de S-fase te induceren. Inductie van c-Myc door dit mechanisme draagt ​​bij aan de inductie van DNA-schaderespons en afwijkende cellulaire DNA-replicatie die leidt tot genomische instabiliteit. In een recent gepubliceerde studie werd aangetoond dat E1A de cruciale DNA-replicatie-initiatiefactor Cdt1 tot hoge niveaus induceert, wat resulteert in verhoogde replicatieoorsprongactiviteit en in de late S-fase inductie van DNA-schaderespons en cellulaire DNA-herreplicatie. Met behulp van de DNA-vezeltest met één molecuul werd ontdekt dat E1A significante veranderingen in de dynamiek van DNA-replicatie induceert en globale veranderingen in oorsprongactivering lijkt te veroorzaken.

Cdt1 is een cruciale DNA-replicatie-initiatiefactor waarvan de niveaus oscilleren tijdens de voortgang van de celcyclus. In late G1 stijgen de niveaus ervan om DNA-replicatie te starten. Aan het begin van de S-fase wordt het onmiddellijk afgebroken door de E3-ligase, zodat oorsprongen die al eenmaal zijn afgevuurd, niet opnieuw worden geactiveerd in de S-fase en er geen herreplicatie binnen een enkele celcyclus plaatsvindt. Verminderde afbraak van Cdt1 in de S-fase door de E3-ligase is het belangrijkste mechanisme waarmee het cellulaire DNA opnieuw wordt gerepliceerd. Er werd ontdekt dat in E1A tot expressie brengende cellen Cdt1-niveaus hoog blijven in de S-fase, wat een inefficiënte afbraak van Cdt1 suggereert, wat kan bijdragen aan uitgebreide herreplicatie van cellulair DNA dat de onderzoekers in de late S-fase waarnamen.

Het Myst-familie-eiwit HBO1 (Myst2, KAT7) is een histonacetyltransferase dat een belangrijke rol speelt bij de initiatie van replicatie en ook bijdraagt ​​aan de herreplicatie van DNA. HBO1 werkt rechtstreeks samen met Cdt1 en functioneert als een co-activator van Cdt1 bij het initiëren van replicatie. Het associeert ook met replicatieoorsprong en stimuleert oorsprongactivering door H4 K5, K8 en K12 te acetyleren. Overexpressie van HBO1 induceert herreplicatie van DNA. De verrijking van chromatine-modificaties, waaronder acetylering van H4-histonen aan de oorsprong, heeft een sterke invloed op de activering van de oorsprong. Aldus dwingt E1A, bij afwezigheid van een groot aantal door serum gestimuleerde proliferatiesignalen, cellen om de S-fase binnen te gaan met behulp van verschillende compensatiemechanismen. Ongecontroleerd cellulair DNA-replicatieprogramma veroorzaakt polyploïdie, het kenmerk van kanker. Het is opwindend dat een viraal oncogen zoals E1A het cellulaire DNA-replicatieprogramma verandert. Dit roept een aantal belangrijke vragen op met betrekking tot het mechanisme van replicatiestress veroorzaakt door een viraal oncogen. Hoe induceert E1A bijvoorbeeld herreplicatie van DNA? Verandert E1A-stimulatie van HBO1 het initiatiemechanisme en of HBO1-gemedieerde chromatine-modificaties aan de oorsprong herreplicatie bevorderen?

SPECIFIEK DOEL VAN DE STUDIE:

Ons specifieke doel is om te bepalen of de stimulatie van HBO1-activiteit door E1A al dan niet een rol speelt bij gedereguleerde DNA-replicatie, en zo ja, om het mechanisme te bepalen.

1. Met behulp van standaardassays zullen de onderzoekers bepalen of E1A aan HBO1 bindt om zijn HAT-activiteit te induceren
2. Met behulp van tijdelijke en virusinfectietesten zullen de onderzoekers bepalen of stimulatie van HBO1 HAT-activiteit door E1A de pre-replicatieve complexvorming (Pre-RC) verbetert en of door E1A geïnduceerde HAT-activiteit kwalitatief en kwantitatief de H4-acetylering in de oorspronkelijke regio's verandert.
3. de onderzoekers zullen bepalen of E1A-stimulatie van HAT-activiteit van HBO1 bijdraagt ​​aan herreplicatie van DNA.

ONDERZOEKSONTWERP EN METHODEN:

Het doel van deze studie is om te bepalen of stimulatie van HBO1 HAT-activiteit door E1A (i) de initiatie verbetert (ii) kwalitatieve en kwantitatieve veranderingen in de acetylering van H4 K5, K8 en K12 in het oorspronkelijke gebied induceert, en (iii) herstel verbetert. replicatie die optreedt in E1A+ cellen. Als verhoogde HAT-activiteit een of meer van deze functies kan stimuleren, zou dit kunnen verklaren hoe deze eigenschap van E1A zou bijdragen aan de inductie van afwijkende DNA-replicatie.

1. E1A-binding aan WT en HAT-deficiënt HBO1.

   de onderzoekers zullen eerst bepalen of E1A direct aan HBO1 bindt door de GST-binding en in vivo co-IP-experimenten uit te voeren. Als binding wordt bevestigd, zullen de onderzoekers de bindingsplaatsen op beide eiwitten in kaart brengen. de onderzoekers zullen dan mutanten van beide eiwitten isoleren die de interacties opheffen. Alle E1A-mutanten zullen worden geëvalueerd op hun interacties met Rb en ​​p300 en alleen mutanten die hun vermogen behouden om aan deze eiwitten te binden, zullen worden gebruikt. Het zal nodig zijn om een ​​HBO1-mutant te isoleren die de E1A-bindingscapaciteit behoudt maar de HAT-activiteit mist. In deze studies zal een veelgebruikte HAT-deficiënte mutant G435A worden gebruikt. Als E1A aan deze mutant bindt, zal het een waardevolle mutant zijn om te bevestigen dat door E1A geïnduceerde HAT-activiteit cruciaal is voor het stimuleren van replicatie-initiatie. Als deze HBO1-mutant niet aan E1A bindt, zal het belangrijk zijn om nieuwe HBO1-mutanten te isoleren die E1A-bindingscapaciteit behouden maar geen HAT-activiteit hebben.

2. Rol van E1A-geïnduceerde HBO1 HAT-activiteit bij oorsprongactivering:

   Eerst zullen de onderzoekers bepalen of E1A associeert met replicatieoorsprongen en of deze associatie HBO1 vereist. de onderzoekers zullen de MCM4-oorsprong gebruiken die in kaart wordt gebracht in het intergengebied tussen PRKDC en (Protein Kinase, DNA-Activated, Catalytic Polypeptide) en MCM4-genen. Eerst zullen de onderzoekers U2OS-cellen transfecteren met plasmiden die relevante eiwitten tot expressie brengen en vervolgens hun bezetting in oorsprongsequenties bepalen met behulp van ChIP-assays. Plasmiden die epitoop-gelabeld WT HBO1 of mutante derivaten tot expressie brengen, samen met plasmiden die WT of mutante E1A-eiwitten tot expressie brengen, zullen tot expressie worden gebracht in U2OS-cellen, waarna de bezetting van deze eiwitten op oorsprongregio's zal worden gekwantificeerd met behulp van antilichamen, indien van toepassing. Meestal worden in deze experimenten, met behulp van relevante antilichamen, ChIP-assays uitgevoerd met primerparen die oorsprongsgebieden omvatten en ook regio's die ver van de oorsprong liggen. De bezetting van initiatiefactoren is meervoudig verhoogd in het oorsprongsgebied in vergelijking met die van 2 KB stroomopwaartse of stroomafwaartse regio's. Het laden van MCM-complex samen met Cdt1 op de oorsprong is een indicatie dat initiatie van replicatie plaatsvindt in die oorsprong en wordt meestal als volgt getest in ChIP-re-ChIP-assays: Eerst zal het laden van HBO1 naar de oorsprong worden bevestigd met behulp van epitoopspecifieke antilichamen in de eerste chip. De anti-HBO1-precipitaten zullen opnieuw worden gechipt met anti-MCM3-antilichamen. Het laden van MCM3-helicase naar de oorsprong vindt plaats na Cdt1-binding en is afhankelijk van HBO1 HAT-activiteit. Normale hoeveelheden MCM3 worden gedetecteerd na opnieuw ChIP-en in E1A+ controlemonsters. Als een verminderde hoeveelheid MCM3 wordt teruggevonden in reChIP-assays wanneer mutant E1A- of HBO1-mutant (bijv. HBO1 G435A) wordt gebruikt, zou dit aangeven dat stimulering van HAT-activiteit door E1A cruciaal is voor maximale oorsprongactiviteit in E1A+-cellen. Dit type test dat met succes door anderen is gebruikt, heeft een aanzienlijke flexibiliteit doordat mutante eiwitten snel kunnen worden getest. Deze ChIP-reChiP-assays worden in verschillende combinaties herhaald om de E1A-belasting te bepalen.

   Deze resultaten zullen worden uitgebreid naar assays voor virusinfecties. Door geneesmiddelbehandeling geïsoleerde G1-specifieke cellen zullen worden geïnfecteerd met Ad-vectoren die epitoop-gelabelde eiwitten tot expressie brengen, indien van toepassing. Associatie van E1A en HBO1 en hun mutante derivaten zal worden bepaald. Deze test stelt ons in staat om het effect van E1A-gestimuleerde HAT-activiteit bij het afvuren van de oorsprong te bevestigen en de effecten van E1A op het afvuren van de oorsprong te bestuderen, indien aanwezig, anders dan het verhogen van de HAT-activiteit van HBO1. Bij c-Myc-inductie door E1A is bijvoorbeeld geen HAT-activiteit betrokken.

3. Effecten van E1A induceerden HBO1 HAT-activiteit bij de acetylering van H4, K5, K8 en K12.

   Om dit te beoordelen, zullen de onderzoekers het chromatine dat is bereid uit met virus geïnfecteerde cellen, ChIP'en met de oorsprongspecifieke primers en epitoopspecifieke antilichamen om de oorsprongbelasting van HBO1 te detecteren. de onderzoekers zullen vervolgens de ChIP-precipitaten opnieuw chippen met behulp van anti-H4 tetra-Ac-antilichamen om K5-, K8- en K12-acetylering te detecteren. In cellen die E1A en HBO1 tot expressie brengen, zal H4-acetylering aanzienlijk worden verhoogd in vergelijking met cellen die alleen met HBO1-virus zijn geïnfecteerd. H4-acetylering kan worden beïnvloed, afhankelijk van de gebruikte mutanten.

4. E1A stimuleerde HBO1 HAT-activiteit bij herreplicatie.

   Van overexpressie van HBO1 is aangetoond dat het DNA-replicatie induceert. Om te bepalen of E1A HBO1 gebruikt bij het induceren van herreplicatie door de HBO1 HAT-activiteit te stimuleren, zullen de onderzoekers S-fase-verrijkte cellen (geïsoleerd door dubbel thymidineblok) infecteren met Ad-virussen die de WT- of mutante E1A-eiwitten tot expressie brengen, samen met Ad-vectoren die HBO1-varianten tot expressie brengen. (bijv. HAT inactief), laat de infectie zo nodig doorgaan en kwantificeer vervolgens de populatie van cellen die > 4N DNA-inhoud bevatten met behulp van een flowcytometer. Als door E1A gesimuleerde HBO1 HAT-activiteit belangrijk is voor herreplicatie, zullen HAT-defecte HBO1-mutanten geen herreplicatie induceren, zelfs niet in de aanwezigheid van E1A. E1A-mutanten die niet aan HBO1 kunnen binden, zullen ook een vergelijkbaar fenotype vertonen.

5. E1A-effecten op H4-acetyleringen bij opnieuw replicerende oorsprongen:

   Om de H4-acetyleringen in opnieuw replicerende oorsprongen te bestuderen, moeten de onderzoekers weten welke van de cellulaire oorsprongen herreplicatie ondergaan in E1A+-cellen in de late S-fase. de onderzoekers zijn van plan de oorsprong te identificeren die is geactiveerd in E1A + -cellen, inclusief degenen die zich opnieuw vermenigvuldigen. Zodra de onderzoekers één of twee opnieuw replicerende oorsprongen identificeren, zullen de onderzoekers de acetyleringen kwantificeren met behulp van deze oorsprongen in cellen die epitoop-gelabelde WT en mutante HBO1-allelen en E1A tot expressie brengen. de onderzoekers anticiperen op kwalitatieve of kwantitatieve (of beide) H4-acetyleringen als gevolg van E1A.

6. Verwachte resultaten en valkuilen:

Aan het einde van alle voorgestelde experimenten verwachten de onderzoekers te bepalen of stimulatie van HBO1 HAT-activiteit door E1A cruciaal is voor oorsprongactivering in E1A+-cellen en of door E1A geïnduceerde HAT-activiteit een rol speelt bij herreplicatie. De onderzoekers voorzien geen technische of andere problemen, waaronder het verkrijgen van relevante reagentia.