Vliv onkogenu adenoviru E1A na dynamiku replikace DNA

POZADÍ:

Protein E1A s 243 aminokyselinami (také známý jako malý protein E1A, transformující protein E1A) kódovaný levým koncem genomu lidského adenoviru (Ad) typu 2 nebo 5 byl studován v různých kontextech, včetně jako model spolupracujícího onkoproteinu, apoptózy. indukující protein a jako terapeutický onkolytický protein. Všechny tyto vlastnosti jsou spojeny s jeho schopností rychle indukovat S fázi v různých buňkách. E1A řídí většinu těchto účinků interakcí s řadou komplexů remodelujících chromatin, včetně proteinů rodiny Rb a proteinů HAT p300 a CBP.

Indukce E2F interakcemi E1A-Rb-HDAC je dobře zdokumentována, zatímco důsledky interakcí E1A-p300/CBP v progresi buněčného cyklu nejsou jasné. Předchozí studie ukázaly, že p300/CBP zabraňuje předčasnému vstupu klidových buněk do S fáze potlačením transkripce c-Myc prostřednictvím tripartitního represorového komplexu sestávajícího z p300, YY1, HDAC3. E1A se váže na p300 a disociuje represorový komplex pro indukci S fáze. Indukce c-Myc tímto mechanismem přispívá k indukci reakce na poškození DNA a aberantní buněčné replikaci DNA, která vede ke genomové nestabilitě. V nedávno publikované studii bylo prokázáno, že E1A indukuje klíčový iniciační faktor DNA replikace Cdt1 na vysoké hladiny, což vede ke zvýšené aktivitě počátku replikace a v pozdní S fázi, indukci reakce na poškození DNA a re-replikaci buněčné DNA. Pomocí testu jednomolekulárních vláken DNA bylo zjištěno, že E1A indukuje významné změny v dynamice replikace DNA a zdá se, že vyvolává globální změny v aktivaci počátku.

Cdt1 je klíčový faktor iniciace replikace DNA, jehož hladiny během progrese buněčného cyklu oscilují. V pozdní G1 jeho hladiny stoupají, aby zahájily replikaci DNA. Na začátku S fáze je rychle degradován E3 ligázou, takže počátky, které jsou již jednou vypáleny, se znovu nespustí v S fázi a nedojde k opětovné replikaci v rámci jediného buněčného cyklu. Zhoršená degradace Cdt1 v S fázi pomocí E3 ligázy je hlavním mechanismem, kterým buněčná DNA podléhá opětovné replikaci. Bylo objeveno, že v buňkách exprimujících E1A zůstávají hladiny Cdt1 vysoké v S fázi, což naznačuje neefektivní degradaci Cdt1, která může přispívat k rozsáhlé re-replikaci buněčné DNA, kterou výzkumníci pozorovali v pozdní S fázi.

Protein HBO1 rodiny Myst (Myst2, KAT7) je histonacetyltransferáza, která hraje hlavní roli při zahájení replikace a také přispívá k re-replikaci DNA. HBO1 přímo interaguje s Cdt1 a funguje jako koaktivátor Cdt1 při zahájení replikace. Také se spojuje s počátkem replikace a stimuluje aktivaci počátku acetylací H4 K5, K8 a K12. Nadměrná exprese HBO1 indukuje re-replikaci DNA. Obohacení modifikací chromatinu včetně acetylace histonů H4 na počátku silně ovlivňuje aktivaci počátku. E1A tedy v nepřítomnosti velkého množství sérem stimulovaných proliferačních signálů nutí buňky vstoupit do S fáze pomocí několika kompenzačních mechanismů. Nekontrolovaný program replikace buněčné DNA způsobuje polyploidii, která je charakteristickým znakem rakoviny. Je vzrušující, že virový onkogen, jako je E1A, mění program replikace buněčné DNA. To vyvolává řadu důležitých otázek souvisejících s mechanismem replikačního stresu vyvolaného virovým onkogenem. Například, jak E1A indukuje re-replikaci DNA? Změní E1A stimulace HBO1 iniciační mechanismus a zda modifikace chromatinu zprostředkované HBO1 na počátku podporují re-replikaci?

KONKRÉTNÍ CÍL STUDIE:

Naším konkrétním cílem je určit, zda stimulace aktivity HBO1 pomocí E1A hraje roli v deregulované replikaci DNA, a pokud ano, určit mechanismus.

1. Pomocí standardních testů vědci určí, zda se E1A váže na HBO1, aby indukovala svou aktivitu HAT
2. Pomocí testů přechodné a virové infekce vědci určí, zda stimulace aktivity HBO1 HAT pomocí E1A zvyšuje tvorbu pre-replikativního komplexu (Pre-RC) a zda aktivita HAT indukovaná E1A kvalitativně a kvantitativně mění acetylaci H4 v oblastech původu.
3. vyšetřovatelé určí, zda E1A stimulace HAT aktivity HBO1 přispívá k re-replikaci DNA.

NÁVRH A METODY VÝZKUMU:

Cílem této studie je zjistit, zda stimulace aktivity HBO1 HAT pomocí E1A (i) zvyšuje iniciaci (ii) indukuje kvalitativní a kvantitativní změny v acetylaci H4 K5, K8 a K12 v oblasti původu a (iii) zvyšuje re- replikace, ke které dochází v E1A+ buňkách. Pokud zvýšená aktivita HAT může stimulovat jednu nebo více z těchto funkcí, mohlo by to vysvětlit, jak by tato vlastnost E1A přispěla k indukci aberantní replikace DNA.

1. E1A vazba na WT a HAT deficitní HBO1.

   vyšetřovatelé nejprve určí, zda se E1A přímo váže na HBO1 provedením GST vazby a in vivo ko-IP experimentů. Pokud je vazba potvrzena, výzkumníci zmapují vazebná místa na obou proteinech. vyšetřovatelé pak izolují mutanty obou proteinů, které ruší interakce. Všechny mutanty E1A budou hodnoceny na jejich interakce s Rb a p300 a budou použity pouze mutanty, které si zachovají svou schopnost vázat se na tyto proteiny. Bude nutné izolovat mutant HBO1, který si zachovává vazebnou kapacitu E1A, ale postrádá aktivitu HAT. V těchto studiích bude použit široce používaný HAT deficitní mutant G435A. Pokud se E1A váže k tomuto mutantu, bude to cenný mutant pro potvrzení, že aktivita HAT indukovaná E1A je kritická pro stimulaci zahájení replikace. Pokud se tento mutant HBO1 neváže na E1A, bude důležité izolovat nové mutanty HBO1, které si zachovávají vazebnou kapacitu E1A, ale postrádají aktivitu HAT.

2. Role E1A indukované aktivity HBO1 HAT v aktivaci počátku:

   Nejprve vyšetřovatelé určí, zda E1A souvisí s počátky replikace a zda tato asociace vyžaduje HBO1. vyšetřovatelé použijí počátek MCM4, který mapuje intergenovou oblast mezi PRKDC a geny (proteinkináza, DNA-aktivovaný, katalytický polypeptid) a MCM4. Nejprve výzkumníci transfekují buňky U2OS plasmidy exprimujícími relevantní proteiny a poté určí jejich obsazení v původních sekvencích pomocí ChIP testů. Plazmidy exprimující epitopově značený WT HBO1 nebo mutantní deriváty spolu s plazmidy exprimujícími WT nebo mutantní E1A proteiny budou exprimovány v buňkách U2OS, poté bude kvantifikováno obsazení těchto proteinů v oblastech původu pomocí protilátek, jak je vhodné. Typicky se v těchto experimentech s použitím relevantních protilátek provádějí testy ChIP s páry primerů zahrnujícími oblasti původu a také oblasti, které jsou daleko od původu. Obsazení iniciačních faktorů je v počáteční oblasti několikanásobně zvýšeno ve srovnání s 2KB upstream nebo downstream regiony. Nanášení komplexu MCM spolu s Cdt1 na počátky je známkou toho, že iniciace replikace nastává v tomto počátku a obvykle se testuje v testech ChIP-re-ChIP následovně: Za prvé, nanášení HBO1 do počátků bude potvrzeno pomocí protilátek specifických pro epitop v první Chip. Precipitáty anti-HBO1 budou re-ChIPed s anti-MCM3 protilátkami. Nanášení helikázy MCM3 k počátkům nastává po navázání Cdt1 a závisí na aktivitě HBO1 HAT. Normální množství MCM3 bude detekováno po re-ChIP-ingu v kontrolních vzorcích E1A+. Pokud se v testech reChIP získá snížené množství MCM3, když mutant E1A nebo HBO1 (např. HBO1 G435A), by to znamenalo, že stimulace aktivity HAT pomocí E1A je kritická pro maximální aktivitu původu v E1A+ buňkách. Tento typ testu, který byl úspěšně použit jinými, má značnou flexibilitu v tom, že mutantní proteiny mohou být rychle testovány. Tyto ChIP-reChiP testy se budou opakovat v různých kombinacích, aby se určilo zatížení E1A.

   Tyto výsledky budou rozšířeny na testy virové infekce. G1 specifické buňky izolované ošetřením léčivem budou infikovány Ad vektory exprimujícími epitopově značené proteiny, jak je vhodné. Bude stanovena asociace E1A a HBO1 a jejich mutantních derivátů. Tento test nám umožní potvrdit účinek E1A stimulované aktivity HAT při počátečním spouštění a studovat účinky E1A na počáteční spouštění, pokud existuje, jiné než zvýšení HAT aktivity HBO1. Například indukce c-Myc pomocí E1A nezahrnuje aktivitu HAT.

3. Účinky E1A indukovaly aktivitu HBO1 HAT při acetylaci H4, K5, K8 a K12.

   Aby to bylo možné vyhodnotit, vědci provedou ChiIP chromatin připravený z buněk infikovaných virem pomocí primerů specifických pro původ a epitopově specifických protilátek, jak je vhodné pro detekci naložení původu HBO1. vyšetřovatelé pak znovu čipují precipitáty ChIP pomocí anti-H4 tetra-Ac protilátek pro detekci acetylace K5, K8 a K12. V buňkách exprimujících E1A a HBO1 bude acetylace H4 značně zvýšena ve srovnání s buňkami infikovanými samotným virem HBO1. V závislosti na použitých mutantech může být ovlivněna acetylace H4.

4. E1A stimuloval aktivitu HBO1 HAT při opětovné replikaci.

   Ukázalo se, že nadměrná exprese HBO1 indukuje replikaci DNA. Aby bylo možné určit, zda E1A používá HBO1 při indukci re-replikace stimulací aktivity HBO1 HAT, vyšetřovatelé infikují buňky obohacené o fázi S (izolované dvojitým thymidinovým blokem) viry Ad exprimujícími proteiny WT nebo mutantní E1A spolu s vektory Ad exprimujícími varianty HBO1. (např. HAT neaktivní), nechte infekci pokračovat podle potřeby a poté kvantifikujte populaci buněk obsahujících >4N obsah DNA pomocí průtokového cytometru. Pokud je aktivita HBO1 simulovaná E1A důležitá pro opakovanou replikaci HAT defektní mutanty HBO1 nevyvolají opakovanou replikaci ani v přítomnosti E1A. Mutanty E1A, které se nemohou vázat na HBO1, budou také vykazovat podobný fenotyp.

5. Účinky E1A na acetylace H4 v opakujících se počátcích:

   Aby bylo možné studovat acetylace H4 v re-replikujících se počátcích, výzkumníci potřebují vědět, které z buněčných počátků podléhají re-replikaci v E1A+ buňkách v pozdní S fázi. vyšetřovatelé plánují identifikovat počátky aktivované v buňkách E1A+ včetně těch, které se znovu replikují. Jakmile vyšetřovatelé identifikují jeden nebo dva znovu se replikující počátky, kvantifikují acetylace pomocí těchto počátků v buňkách exprimujících epitopem značené alely WT a mutantní alely HBO1 a E1A. vyšetřovatelé předpokládají kvalitativní nebo kvantitativní (nebo obojí) v acetylacích H4 způsobených E1A.

6. Očekávané výsledky a úskalí:

Na konci všech navrhovaných experimentů vědci očekávají, že určí, zda stimulace aktivity HBO1 HAT pomocí E1A je kritická pro aktivaci počátku v buňkách E1A+ a zda má aktivita HAT indukovaná E1A roli při opětovné replikaci. Vyšetřovatelé nepředpokládají žádné technické nebo jiné problémy včetně získávání relevantních činidel.