急性心筋梗塞における冠動脈血栓のプロテオームプロファイリング

虚血性心疾患は、障害調整生存年に基づいて評価されるように、世界的な疾患負担の主要な原因です。

ST 上昇型心筋梗塞 (STEMI) は患者の 90% で冠状動脈閉塞性血栓症に関連しており、非 ST 上昇型心筋梗塞 (NSTEMI) は症例の 26% のみです。 この点に関して、冠状動脈血栓の組成にますます注目が集まっている。 急性 STEMI では、閉塞性血栓の血小板とフィブリンの含有量は虚血時間に大きく依存するため、これが冠動脈再灌流に使用される薬剤またはデバイスの有効性に大きな影響を与える可能性があると推測できます。

血小板、赤血球、単球、好中球などのいくつかの循環細胞タイプと、血栓形成プロセスを調節する血漿分子の中で、血小板は血栓の主要な細胞成分を構成し、それらの活性化は血栓形成に不可欠です。 血栓症における血小板の役割は深く特徴付けられていますが、ヒト冠状動脈血栓内の血小板活性化と焦点接着の根底にある分子メカニズム、組成、閉塞血栓の時間変化、および他の細胞との相互作用は明確に解明されていません。血栓性物質へのアクセスが困難です。 血栓吸引は、STEMI および NSTEMI に対する一次経皮的冠動脈インターベンション (PCI) の補助的戦略として物議を醸す役割を果たしていますが、冠動脈樹で進められた吸引カテーテルによる閉塞性血栓の抽出に依存しており、取得するためのユニークな機会を構成しています。 AMIに苦しむ患者からの冠動脈血栓。

時間の経過と病態生理学に従って血栓形成の原因となる可変分子経路を定義することは、より新しい治療戦略への道を開く可能性があります。

研究の仮説 冠状動脈血栓は、形成の病態生理学（びらん、プラーク破裂または金属ストラット露出）および症状の発症からの経過時間に従って、有意な変化を受ける。

冠動脈血栓の分子組成とそのプロテオミクスおよびメタボロミクス パターンの正確な定義は、より新しい治療戦略の標的を特定する可能性があります。

この研究の目的は、AMI における冠動脈血栓の分子組成を解明すること、血栓形成に関連する表現型の変化を分子レベルで理解すること、疾患の発症に関与する、または血栓形成の時期に関連する新しい潜在的要因を明らかにすることです。

STEMIおよび閉塞性梗塞関連動脈またはNSTEMIおよび原因動脈の目に見える血栓のいずれかを有する、ACSのために入院した一連の連続した患者は、血栓吸引に適していると見なされます。 PCI は、大腿骨アクセスまたは橈骨アクセスの標準的な手順で実施されます。 すべての患者は、アセチルサリチル酸 (毎日 100 mg) と P2Y12 阻害剤 - クロピドグレル (600 mg、その後毎日 75 mg)、プラスグレル (60 mg、その後毎日 10 mg) またはチカグレロール (毎日 180 mg) を受け取ります。 動脈シースの挿入後、すべての患者に 70 IU/kg のヘパリンを投与します。

病変全体にガイドワイヤを配置した後、血栓吸引システムを穏やかに吸引しながら前進させ、原因病変を数回通過させます。

登録された各患者からの凍結乾燥血栓は、タンパク質、代謝産物（アミノ酸およびアシルカルニチン）、および極性脂質に関して広範な分子特性評価を受けます。

血栓からの極性代謝物および脂質は、検証済みの方法に従って抽出および分析されます。5 mg の湿った血栓が、重水素化されたアミノ酸およびカルニチンの内部標準と、リゾ スフィンゴミエリン 100 μg/ml を内部として含む 330 μL のメタノール溶液に追加されます。リピドミクスのスタンダード。 これらのソリューションは、45 ° C で 50 分間インキュベートし、最後に 2 つのアリコートに分けます。 最初のものは、以前に報告された CSF の分析で既に使用されている LC-MS/MS メソッドに従って、アミノ酸とアシルカルニチンを分析するために使用されます。 2 番目のアリコートは、LC-MS/MS によるリン脂質のスクリーニングに使用されます。 得られたデータは、MarkerLynx および NeoLynx ソフトウェアを使用して定量化され、GraphPad Prism、Simca P+、および MetaboAnalyst ソフトウェアを使用して統計的に調査されます。

凍結乾燥血栓は、フィルター支援サンプル準備 (FASP) プロトコルによって消化されます。 次に、すでに報告されているように、発現したタンパク質を特定し、同時に定量化するために、ラベルフリーのショットガンプロテオミクス実験を実行するプラットフォーム nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS によって、各サンプルのインストルメンタルトリプリケートが取得されます。 この研究の結果は、バイオインフォマティクス分析に使用できる、急性心筋梗塞の冠状動脈血栓の間に発現したタンパク質のリストになります。

データは、専用のソフトウェア (Profile Analysis、Bruker、Markerlynx) によって処理されます。 ハイライトされた代謝産物/タンパク質は、データベースおよび断片化分析によって識別されます。

特にメタボロミクスとリピドミクスでは、データを処理してピークのデコンボリューションとアライメント、ノイズ除去、および総イオン数の正規化を取得し、分析された各サンプルで検出されたすべてのピークの関連する相対強度を含む質量ペアの表を作成します。 次に、SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB、ウメオ、スウェーデン) を使用して、データ マトリックスを多変量解析 (PCA; PLS-DA) に使用します。

マルチオミクス研究とデータ処理により、研究対象の各臨床グループのフレームワークとして興味深い分子のパネルが利用可能になります。 これらの生物学的化合物は、インシリコ分析にかけられ、急性心筋梗塞における冠動脈血栓の生理学および分子恒常性における機能的意味が再構築されます。 このようなデータのメタ分析を実行するために、主に Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems、Mountain View、CA) を使用します。 パスウェイ分析と遺伝子オントロジーにより、特定の表現型に対して阻害および/または刺激される代謝経路と二次遺伝子/タンパク質を特定し、その結果、潜在的なエフェクター分子および/または薬理学的標的を分類することが可能になります。