Perfil Proteômico do Trombo Coronário no Infarto Agudo do Miocárdio

A doença cardíaca isquêmica é o principal contribuinte para a carga mundial de doenças, conforme avaliado com base em anos de vida ajustados por incapacidade.

O Infarto do Miocárdio com Elevação do ST (STEMI) está associado a uma trombose coronariana oclusiva em 90% dos pacientes, e o Infarto do Miocárdio sem Elevação do ST (NSTEMI) apenas em 26% dos casos. A este respeito, cada vez mais atenção é dada à composição do trombo coronário. No IAMCSST agudo, o conteúdo de plaquetas e fibrina no trombo oclusivo é altamente dependente do tempo de isquemia, podendo-se inferir que este pode ter um impacto substancial na eficácia de drogas ou dispositivos utilizados para reperfusão coronariana.

Dentre vários tipos de células circulantes - plaquetas, eritrócitos, monócitos e neutrófilos -, bem como moléculas do plasma, modulando o processo de trombose, as plaquetas constituem o principal componente celular do trombo e sua ativação é essencial para a formação do trombo. Embora o papel das plaquetas na trombose tenha sido profundamente caracterizado, os mecanismos moleculares subjacentes à ativação plaquetária e à adesão focal nos trombos coronários humanos, a composição, as mudanças temporais do trombo oclusivo e sua interação com as outras células não foram claramente elucidados, principalmente devido ao difícil acesso ao material trombótico. A aspiração de trombos, embora tenha um papel controverso como estratégia adjuvante na intervenção coronária percutânea (ICP) primária para STEMI e NSTEMI, baseia-se na extração de trombos oclusivos por um cateter de aspiração, avançado na árvore arterial coronária e constitui uma oportunidade única para obter trombos coronários de pacientes com IAM.

Definir as vias moleculares variáveis ​​responsáveis ​​pela formação do trombo de acordo com o lapso de tempo e a fisiopatologia pode abrir caminho para novas estratégias terapêuticas.

Hipótese do estudo O trombo coronário sofre modificação significativa de acordo com a fisiopatologia de sua formação (erosão, ruptura da placa ou exposição de hastes metálicas) e tempo decorrido desde o início dos sintomas.

A definição exata da composição molecular do trombo coronariano e de seus padrões proteômicos e metabolômicos pode indicar o alvo de novas estratégias terapêuticas.

Os objetivos do estudo são: elucidar a composição molecular do trombo coronário no IAM, compreender, a nível molecular, alterações fenotípicas relacionadas à formação do trombo, destacar novos fatores potenciais envolvidos no surgimento da doença ou relacionados ao tempo de formação do trombo.

Uma série consecutiva de pacientes admitidos por uma SCA, com STEMI e artéria relacionada ao infarto ocluída ou NSTEMI e trombo visível na artéria culpada será considerada adequada para aspiração de trombo. A ICP será realizada com um procedimento padrão, com acesso femoral ou radial. Todos os pacientes receberão ácido acetilsalicílico (100 mg por dia) e um inibidor de P2Y12 - clopidogrel (600 mg, depois 75 mg por dia), prasugrel (60 mg, depois 10 mg por dia) ou ticagrelor (180 mg por dia). Após a inserção da bainha arterial, cada paciente receberá 70 UI/kg de heparina.

Após o posicionamento do fio-guia na lesão, o sistema de aspiração do trombo será avançado com sucção suave e várias passagens serão realizadas através da lesão culpada.

Os trombos liofilizados de cada paciente inscrito serão submetidos a extensa caracterização molecular em termos de proteínas, metabólitos (Aminoácidos e Acilcarnitinas) e lipídios polares.

Metabólitos polares e lipídios do trombo serão extraídos e analisados ​​seguindo uma metodologia validada: 5 mg de trombo úmido serão adicionados a 330 μL de solução de metanol contendo padrões internos deuterados de aminoácidos e carnitinas e liso-esfingomielina 100 µg/ml como interno padrão para lipidômica. Essas soluções serão incubadas a 45 °C por 50 min e finalmente divididas em duas alíquotas. O primeiro será utilizado para análise de aminoácidos e acil-carnitinas seguindo nosso método de LC-MS/MS já utilizado na análise de LCR conforme relatado anteriormente. A segunda alíquota será empregada para triagem de fosfolipídios por LC-MS/MS. Os dados obtidos serão quantificados pelos softwares MarkerLynx e NeoLynx, e investigados estatisticamente pelos softwares GraphPad Prism, Simca P+ e MetaboAnalyst.

O trombo liofilizado será digerido pelo protocolo Filter Aided Sample Prep (FASP). Em seguida, triplicatas instrumentais serão adquiridas para cada amostra por uma plataforma nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS realizando experimentos de proteômica shotgun label free para identificar e, simultaneamente, quantificar as proteínas expressas conforme já relatado. O resultado deste estudo será uma lista de proteínas expressas durante o trombo coronário no infarto agudo do miocárdio, que poderá ser utilizada para análise bioinformática.

Os dados serão processados ​​por um software dedicado (Profile Analysis, Bruker, Markerlynx). Metabólitos/proteínas destacados serão identificados por banco de dados e por análise de fragmentação.

Especificamente para metabolômica e lipidômica, os dados serão processados ​​para obter deconvolução e alinhamento de pico, denoise e normalização de contagem de íons totais para fornecer uma tabela de pares de massa com intensidades relativas associadas para todos os picos detectados para cada amostra analisada. Em seguida, a matriz de dados será usada para análise multivariada (PCA; PLS-DA) usando SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB, Umeå, Suécia).

Através de pesquisas multi-ômicas e processamento de dados, será disponibilizado um painel de moléculas interessantes como enquadramento para cada grupo clínico estudado. Esses compostos biológicos serão então submetidos a uma análise in silico para reconstruir suas implicações funcionais na fisiologia e homeostase molecular do trombo coronário no infarto agudo do miocárdio. Para realizar essa meta-análise dos dados, usaremos principalmente a Ingenuity Pathways Analysis (IPA), (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Através da análise de Pathways e da Gene Ontology será possível identificar as vias metabólicas e os genes/proteínas secundárias inibidas e/ou estimuladas para um fenótipo específico e consequentemente classificar potenciais moléculas efetoras e/ou alvo farmacológico.