Sepelvaltimotukoksen proteominen profilointi akuutissa sydäninfarktissa

Iskeeminen sydänsairaus on johtava maailmanlaajuisen sairauden aiheuttaja vammaisuuskorjattujen elinvuosien perusteella arvioituna.

ST-korkeakoulun sydäninfarkti (STEMI) liittyy sepelvaltimon okklusiiviseen tromboosiin 90 %:lla potilaista, ja ei-ST-korkeaseen sydäninfarktiin (NSTEMI) vain 26 %:lla tapauksista. Tässä suhteessa kiinnitetään yhä enemmän huomiota sepelvaltimotukoksen koostumukseen. Akuutissa STEMI:ssä verihiutale- ja fibriinipitoisuus okklusiivisessa trombissa on suuresti riippuvainen iskemian ajasta, joten voidaan päätellä, että tällä voi olla merkittävä vaikutus sepelvaltimon reperfuusioon käytettävien lääkkeiden tai laitteiden tehokkuuteen.

Useista kiertävistä solutyypeistä - verihiutaleet, erytrosyytit, monosyytit ja neutrofiilit - samoin kuin plasmamolekyylit, jotka moduloivat tromboosiprosessia, verihiutaleet muodostavat veritulpan tärkeimmän solukomponentin ja niiden aktivaatio on välttämätöntä veritulpan muodostumiselle. Vaikka verihiutaleiden rooli tromboosissa on syvästi karakterisoitu, verihiutaleiden aktivaation ja fokaaliadheesion taustalla olevia molekyylimekanismeja ihmisen sepelvaltimotrombeissa, tukkivan veritulpan koostumusta, aikamuutoksia ja sen vuorovaikutusta muiden solujen kanssa ei ole selvitetty selkeästi, pääasiassa tromboottisen materiaalin vaikea pääsy. Vaikka veritulpan aspiraatiolla on kiistanalainen rooli lisästrategiana primaarisessa perkutaanisessa sepelvaltimointerventiossa (PCI) STEMI:n ja NSTEMI:n hoidossa, se perustuu okklusiivisten trombien poistamiseen aspiraatiokatetrilla, joka on edistynyt sepelvaltimopuussa ja tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden saada AMI-potilaiden sepelvaltimon trombit.

Veritulpan muodostumisesta vastuussa olevien vaihtelevien molekyylireittien määrittäminen aikaviiveen ja patofysiologian mukaan voi tasoittaa tietä uudemmille hoitostrategioille.

Tutkimuksen hypoteesi Sepelvaltimotukos muuttuu merkittävästi muodostumisen patofysiologian (eroosio, plakin repeämä tai metallitukien altistuminen) ja oireiden alkamisen aikaviiveen mukaan.

Sepelvaltimotukoksen ja sen proteomisten ja metabolomisten mallien molekyylikoostumuksen tarkka määritelmä voi tunnistaa uudempien terapeuttisten strategioiden kohteen.

Tutkimuksen tavoitteet ovat: Selvittää sepelvaltimotukoksen molekyylikoostumusta AMI:ssä, ymmärtää molekyylitasolla veritulpan muodostumiseen liittyviä fenotyyppisiä muutoksia, tuoda esiin uusia mahdollisia tekijöitä, jotka liittyvät taudin alkamiseen tai veritulpan muodostumisaikaan.

Peräkkäinen sarja potilaita, jotka on otettu ACS:n takia, joilla on joko STEMI ja infarktiin liittyvä valtimo tukkeutunut tai NSTEMI ja näkyvä veritulppa syyllisvaltimossa, katsotaan sopivaksi veritulpan aspiraatioon. PCI suoritetaan tavallisella menettelyllä joko femoraalisella tai säteittäisellä pääsyllä. Kaikki potilaat saavat asetyylisalisyylihappoa (100 mg päivässä) ja P2Y12-estäjää - klopidogreelia (600 mg, sitten 75 mg päivässä), prasugreelia (60 mg, sitten 10 mg päivässä) tai tikagreloria (180 mg päivässä). Valtimovaipan asettamisen jälkeen jokainen potilas saa 70 IU/kg hepariinia.

Kun ohjainvaijeri on sijoitettu leesion poikki, veritulpan imujärjestelmää viedään eteenpäin kevyellä imulla ja useita kulkuja suoritetaan syyllisen leesion läpi.

Jokaisesta tutkimukseen otetusta potilaasta peräisin olevalle lyofilisoidulle trombille tehdään laaja molekyylikarakterisointi proteiinien, metaboliittien (aminohapot ja asyylikarnitiinit) ja polaaristen lipidien osalta.

Polaariset metaboliitit ja lipidit trombista uutetaan ja analysoidaan validoitua menetelmää noudattaen: 5 mg märkää veritulppaa lisätään 330 µl:aan metanoliliuosta, joka sisältää deuteroituja aminohappojen ja karnitiinien sisäisiä standardeja sekä lysosfingomyeliiniä 100 µg/ml sisäisenä aineena. lipidomiikan standardi. Näitä liuoksia inkuboidaan 45 °C:ssa 50 minuuttia ja lopuksi jaetaan kahteen osaan. Ensimmäistä käytetään aminohappojen ja asyylikarnitiinien analysointiin noudattaen LC-MS/MS-menetelmäämme, jota on jo käytetty CSF-analyysissä, kuten aiemmin on raportoitu. Toista alikvoottia käytetään fosfolipidien seulomiseen LC-MS/MS:llä. Saadut tiedot kvantifioidaan käyttämällä MarkerLynx- ja NeoLynx-ohjelmistoja ja tutkitaan tilastollisesti GraphPad Prism-, Simca P+- ja MetaboAnalyst-ohjelmistoilla.

Lyofilisoitu veritulppa pilkotaan Filter Aided Sample Prep (FASP) -protokollalla. Tämän jälkeen nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS-alusta hankkii kullekin näytteelle instrumentaaliset kolminkertaiset näytteet, joka suorittaa leimattomia haulikkoproteomiikkakokeita ekspressoituneiden proteiinien tunnistamiseksi ja samanaikaisesti kvantifioimiseksi, kuten jo on raportoitu. Tämän tutkimuksen tuloksena on luettelo akuutin sydäninfarktin sepelvaltimotukoksen aikana ilmentyneistä proteiineista, joita voidaan käyttää bioinformatiikkaan.

Tiedot käsitellään erillisellä ohjelmistolla (Profile Analysis, Bruker, Markerlynx). Korostetut metaboliitit/proteiinit tunnistetaan tietokannan ja fragmentaatioanalyysin avulla.

Erityisesti metabolomiikan ja lipidomiikan osalta tiedot käsitellään huippudekonvoluution ja -linjauksen, melun ja kokonaisionimäärän normalisoinnin saamiseksi, jotta saadaan massaparien taulukko ja niihin liittyvät suhteelliset intensiteetit kaikille havaituille huipeille jokaiselle analysoidaan näytteelle. Tämän jälkeen datamatriisia käytetään monimuuttuja-analyysiin (PCA; PLS-DA) käyttäen SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB, Uumaja, Ruotsi).

Multi-omics-tutkimusten ja tietojenkäsittelyn avulla se tarjoaa mielenkiintoisia molekyylejä sisältävän paneelin viitekehykseksi jokaiselle tutkittavalle kliiniselle ryhmälle. Näille biologisille yhdisteille tehdään sitten in-silico-analyysi niiden toiminnallisten vaikutusten rakentamiseksi uudelleen sepelvaltimotukoksen fysiologiaan ja molekulaariseen homeostaasiin akuutissa sydäninfarktissa. Tällaisen meta-analyysin suorittamiseen tiedoista käytämme pääasiassa Ingenuity Pathways Analysis (IPA) -analyysiä (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Pathways-analyysin ja geeniontologian avulla on mahdollista tunnistaa tietyn fenotyypin aineenvaihduntareitit ja sekundaariset geenit/proteiinit, jotka on inhiboitu ja/tai stimuloitu, ja siten luokitella mahdolliset efektorimolekyylit ja/tai farmakologinen kohde.