Koronáriás thrombus proteomikus profilozása akut szívinfarktusban

A fogyatékossághoz igazított életévek alapján értékelve az ischaemiás szívbetegség a vezető szerepet játszik a világ betegségterhében.

Az ST-elevációs szívizominfarktus (STEMI) a betegek 90%-ában társul koszorúér-elzáródásos trombózishoz, a nem ST-elevációs szívizominfarktus (NSTEMI) pedig csak az esetek 26%-ában. Ebben a tekintetben egyre nagyobb figyelmet fordítanak a koszorúér-thrombus összetételére. Akut STEMI-ben az okkluzív thrombus vérlemezke- és fibrintartalma nagymértékben függ az ischaemia idejétől, így arra következtethetünk, hogy ez jelentős hatással lehet a koszorúér-reperfúzióra használt gyógyszerek vagy eszközök hatékonyságára.

Számos keringő sejttípus - vérlemezkék, eritrociták, monociták és neutrofilek -, valamint a trombózis folyamatát moduláló plazmamolekulák közül a vérlemezkék alkotják a trombus fő sejtkomponensét, és aktiválódásuk elengedhetetlen a trombusképződéshez. Bár a vérlemezkék trombózisban betöltött szerepe mélyen jellemzett, a thrombocyta aktiváció és a gócos adhézió mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusok a humán koszorúér trombusokon belül, az elzáró thrombus összetétele, időbeli változásai és a többi sejttel való kölcsönhatása nem tisztázott egyértelműen, elsősorban az a trombózisos anyag nehezen hozzáférhetősége miatt. A thrombus aspiráció, bár ellentmondásos szerepet játszik a primer perkután coronaria intervencióban (PCI) a STEMI és NSTEMI kezelésében, az okkluzív trombusok aspirációs katéterrel történő extrakcióján alapul, amely a szívkoszorúér-fában halad előre, és egyedülálló lehetőséget jelent koszorúér trombusok AMI-ben szenvedő betegektől.

A trombusképződésért felelős, változó molekuláris útvonalak időeltolódás és patofiziológia szerinti meghatározása újabb terápiás stratégiák felé nyithat utat.

A vizsgálat hipotézise A koszorúér-thrombus jelentős módosuláson megy keresztül a képződés patofiziológiája (erózió, plakk szakadás vagy fémrudak expozíciója) és a tünetek megjelenésétől számított időbeli elhúzódás szerint.

A koszorúér thrombus molekuláris összetételének, proteomikai és metabolomikai mintázatainak pontos meghatározása újabb terápiás stratégiák célpontját jelentheti.

A tanulmány célja: a koszorúér-thrombus molekuláris összetételének tisztázása AMI-ben, a thrombus képződéssel kapcsolatos fenotípusos változások molekuláris szintű megértése, a betegség kialakulásában szerepet játszó vagy a trombusképződés idejével kapcsolatos új lehetséges tényezők feltárása.

Az ACS miatt felvett betegek egymást követő sorozata, akiknél vagy STEMI és infarktushoz kapcsolódó artéria elzáródott, vagy NSTEMI és látható trombus van a hibás artériában, alkalmasnak minősülnek a thrombus aspirációjára. A PCI szabványos eljárással történik, femorális vagy radiális hozzáféréssel. Minden beteg acetilszalicilsavat (napi 100 mg) és P2Y12-gátlót kap – klopidogrél (600 mg, majd 75 mg naponta), prasugrel (60 mg, majd 10 mg naponta) vagy ticagrelor (napi 180 mg). Az artériás hüvely behelyezése után minden beteg 70 NE/kg heparint kap.

A vezetődrótnak a lézión keresztül történő elhelyezése után a thrombus aspirációs rendszert enyhe szívással továbbítják, és több átvezetést hajtanak végre a kiváltó lézión.

Az egyes betegektől származó liofilizált trombusokat fehérjék, metabolitok (aminosavak és acilkarnitinek) és poláris lipidek tekintetében kiterjedt molekuláris jellemzésnek vetik alá.

A thrombus poláris metabolitjait és lipidjeit validált módszertan szerint vonják ki és elemzik: 5 mg nedves trombust adnak 330 μl metanolos oldathoz, amely deuterált belső standardokat tartalmaz aminosavakból és karnitinokból, valamint lizo-szfingomielinből 100 µg/ml. a lipidomika szabványa. Ezeket az oldatokat 45 °C-on 50 percig inkubáljuk, majd végül két aliquot részre osztjuk. Az elsőt az aminosavak és az acil-karnitinek elemzésére használjuk, követve az LC-MS/MS-módszerünket, amelyet már használtunk a CSF analízisében, amint azt korábban közöltük. A második alikvot részt a foszfolipidek LC-MS/MS módszerrel történő szűrésére használjuk. A kapott adatokat MarkerLynx és NeoLynx szoftverrel számszerűsítik, statisztikailag pedig GraphPad Prism, Simca P+ és MetaboAnalyst szoftverrel vizsgálják.

A liofilizált trombust a Filter Aided Sample Prep (FASP) protokoll szerint emésztjük. Ezután minden egyes mintához hármas műszeres másolatokat készít egy nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS platform, amely címkementes sörétes proteomikai kísérleteket végez az expresszált fehérjék azonosítása és egyidejűleg mennyiségi meghatározása érdekében, amint azt már közölték. Ennek a vizsgálatnak az eredménye egy lista a koszorúér-thrombus során expresszált fehérjékről akut miokardiális infarktusban, amely felhasználható bioinformatikai elemzéshez.

Az adatokat egy erre a célra szolgáló szoftver (Profile Analysis, Bruker, Markerlynx) dolgozza fel. A kiemelt metabolitokat/fehérjéket adatbázissal és fragmentációs elemzéssel azonosítják.

Kifejezetten a metabolomika és a lipidomika esetében az adatokat a csúcsdekonvolúció és az igazítás, a zaj és a teljes ionszám normalizálása érdekében dolgozzák fel, így tömegpárokat tartalmazó táblázatot kapnak a kapcsolódó relatív intenzitásokkal minden egyes elemzett minta összes kimutatott csúcsához. Ezután az adatmátrixot többváltozós elemzéshez (PCA; PLS-DA) használják a SIMCA-P + 11.0 használatával (Umetrics AB, Umeå, Svédország).

A multi-omika kutatások és adatfeldolgozás révén érdekes molekulák panelje lesz elérhető keretként minden egyes vizsgált klinikai csoport számára. Ezeket a biológiai vegyületeket ezután in-silico elemzésnek vetik alá, hogy újjáépítsék funkcionális hatásaikat a koszorúér-thrombus fiziológiájában és molekuláris homeosztázisában akut miokardiális infarktusban. Az adatok ilyen metaanalízisének elvégzéséhez főként az Ingenuity Pathways Analysis-t (IPA) fogjuk használni (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). A Pathways analízis és a génontológia révén lehetővé válik a metabolikus útvonalak és a másodlagos gének/fehérjék azonosítása, amelyek gátlottak és/vagy stimuláltak egy adott fenotípushoz, és ennek következtében osztályozhatók a potenciális effektormolekulák és/vagy farmakológiai célpontok.