Proteomische profilering van coronaire trombus bij acuut myocardinfarct

Ischemische hartziekte levert de grootste bijdrage aan de wereldwijde ziektelast, zoals beoordeeld op basis van voor beperkingen gecorrigeerde levensjaren.

Myocardinfarct met ST-elevatie (STEMI) wordt geassocieerd met een coronaire occlusieve trombose bij 90% van de patiënten, myocardinfarct zonder ST-elevatie (NSTEMI) slechts in 26% van de gevallen. In dit verband wordt steeds meer aandacht besteed aan de samenstelling van coronaire trombus. Bij acuut STEMI is het gehalte aan bloedplaatjes en fibrine in de occlusieve trombus sterk afhankelijk van de ischemietijd, dus men kan concluderen dat dit een substantiële invloed kan hebben op de werkzaamheid van geneesmiddelen of apparaten die worden gebruikt voor coronaire reperfusie.

Onder verschillende circulerende celtypen - bloedplaatjes, erytrocyten, monocyten en neutrofielen - evenals plasmamoleculen, die het tromboseproces moduleren, vormen bloedplaatjes de belangrijkste cellulaire component van de trombus en hun activering is essentieel voor trombusvorming. Hoewel de rol van bloedplaatjes bij trombose grondig is gekarakteriseerd, zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de activering van bloedplaatjes en focale adhesie in humane coronaire trombi, de samenstelling, tijdsveranderingen van de afsluitende trombus en zijn interactie met de andere cellen niet duidelijk opgehelderd, voornamelijk als gevolg van vanwege de moeilijke toegang tot het trombotische materiaal. Hoewel trombose-aspiratie een controversiële rol speelt als adjunctieve strategie bij primaire percutane coronaire interventie (PCI) voor STEMI en NSTEMI, berust het op de extractie van occlusieve trombi door een aspiratiekatheter, vooruitgeschoven in de coronaire arteriële boom en vormt een unieke kans voor het verkrijgen van coronaire trombi van patiënten die lijden aan AMI.

Het definiëren van variabele moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor trombusvorming volgens tijdsverloop en pathofysiologie kan de weg vrijmaken voor nieuwere therapeutische strategieën.

Hypothese van het onderzoek Coronaire trombus ondergaat een significante wijziging volgens de pathofysiologie van vorming (erosie, plaqueruptuur of blootstelling aan metalen stutten) en het tijdsverloop vanaf het begin van de symptomen.

De exacte definitie van de moleculaire samenstelling van coronaire trombus en van zijn proteomische en metabolomische patronen kan het doelwit van nieuwere therapeutische strategieën identificeren.

Doelen van de studie zijn: de moleculaire samenstelling van coronaire trombus bij AMI ophelderen, op moleculair niveau fenotypische verandering in verband met trombusvorming begrijpen, nieuwe potentiële factoren benadrukken die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van de ziekte of gerelateerd zijn aan het tijdstip van trombusvorming.

Een opeenvolgende reeks patiënten die is opgenomen voor een ACS, met ofwel STEMI en afgesloten infarctgerelateerde arterie of NSTEMI en zichtbare trombus in de veroorzakende arterie, wordt geschikt geacht voor trombusaspiratie. PCI zal worden uitgevoerd met een standaardprocedure, met ofwel femorale of radiale toegang. Alle patiënten krijgen acetylsalicylzuur (100 mg per dag) en een P2Y12-remmer - clopidogrel (600 mg, daarna 75 mg per dag), prasugrel (60 mg, daarna 10 mg per dag) of ticagrelor (180 mg per dag). Na het inbrengen van de arteriële sheath krijgt elke patiënt 70 IE/kg heparine toegediend.

Nadat de voerdraad over de laesie is gepositioneerd, wordt het trombus-aspiratiesysteem met zachte zuigkracht naar voren gebracht en worden verschillende passages door de laesie van de boosdoener uitgevoerd.

De gelyofiliseerde trombus van elke ingeschreven patiënt zal een uitgebreide moleculaire karakterisering ondergaan in termen van eiwitten, metabolieten (aminozuren en acylcarnitines) en polaire lipiden.

Polaire metabolieten en lipiden uit trombus zullen worden geëxtraheerd en geanalyseerd volgens een gevalideerde methodologie: 5 mg natte trombus zal worden toegevoegd aan een 330 μl methanoloplossing die gedeutereerde interne standaarden van aminozuren en carnitines en lyso-sfingomyeline 100 µg/ml bevat als inwendig standaard voor lipidomics. Deze oplossingen worden gedurende 50 minuten bij 45 °C geïncubeerd en uiteindelijk in twee aliquots verdeeld. De eerste zal worden gebruikt om aminozuren en acyl-carnitines te analyseren volgens onze LC-MS/MS-methode die al wordt gebruikt bij de analyse van CSF, zoals eerder gerapporteerd. Het tweede aliquot zal worden gebruikt om fosfolipiden te screenen met LC-MS/MS. De verkregen gegevens worden gekwantificeerd met MarkerLynx- en NeoLynx-software en statistisch onderzocht met GraphPad Prism, Simca P+ en MetaboAnalyst-software.

De gelyofiliseerde trombus wordt verteerd volgens het Filter Aided Sample Prep (FASP)-protocol. Vervolgens zullen instrumentele drievouden voor elk monster worden verkregen door een platform nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS dat labelvrije shotgun proteomics-experimenten uitvoert om tot expressie gebrachte eiwitten te identificeren en tegelijkertijd te kwantificeren, zoals reeds gerapporteerd. Het resultaat van deze studie zal een lijst zijn van tot expressie gebrachte eiwitten tijdens coronaire trombus bij acuut myocardinfarct, die kan worden gebruikt voor bioinformatica-analyse.

Gegevens worden verwerkt door speciale software (Profile Analysis, Bruker, Markerlynx). Gemarkeerde metabolieten/eiwitten zullen worden geïdentificeerd door database en door fragmentatieanalyse.

Specifiek voor metabolomics en lipidomics zullen de gegevens worden verwerkt om piekdeconvolutie en uitlijning, denoise en Total Ion Count-normalisatie te verkrijgen om een ​​tabel te geven van massaparen met bijbehorende relatieve intensiteiten voor alle gedetecteerde pieken voor elk geanalyseerd monster. Vervolgens wordt de datamatrix gebruikt voor multivariate analyse (PCA; PLS-DA) met behulp van SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB, Umeå, Zweden).

Door multi-omics-onderzoek en gegevensverwerking zal een panel van interessante moleculen beschikbaar komen als raamwerk voor elke bestudeerde klinische groep. Deze biologische verbindingen zullen vervolgens worden onderworpen aan een in-silico-analyse om hun functionele implicaties in de fysiologie en moleculaire homeostase van coronaire trombus bij acuut myocardinfarct opnieuw op te bouwen. Om een ​​dergelijke meta-analyse van de gegevens uit te voeren, zullen we voornamelijk gebruikmaken van Ingenuity Pathways Analysis (IPA), (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Door middel van de Pathways-analyse en de Gene Ontology zal het mogelijk zijn om de metabolische routes en de secundaire genen/eiwitten die worden geremd en/of gestimuleerd voor een specifiek fenotype te identificeren en bijgevolg potentiële effectormoleculen en/of farmacologisch doelwit te classificeren.