Proteomic Profiling von Koronarthrombus bei akutem Myokardinfarkt

Die ischämische Herzkrankheit ist der Hauptverursacher der weltweiten Krankheitslast, gemessen auf der Grundlage der behinderungsbereinigten Lebensjahre.

Der ST-Hebungs-Myokardinfarkt (STEMI) ist bei 90 % der Patienten mit einer koronaren Verschlussthrombose assoziiert, der Nicht-ST-Hebungs-Myokardinfarkt (NSTEMI) nur in 26 % der Fälle. In dieser Hinsicht wird der Zusammensetzung von Koronarthromben zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt. Bei akutem STEMI hängt der Blutplättchen- und Fibringehalt im okklusiven Thrombus stark von der Ischämiezeit ab, woraus man schließen kann, dass dies einen erheblichen Einfluss auf die Wirksamkeit von Arzneimitteln oder Geräten haben kann, die für die koronare Reperfusion verwendet werden.

Unter mehreren zirkulierenden Zelltypen – Blutplättchen, Erythrozyten, Monozyten und Neutrophilen – sowie Plasmamolekülen, die den Thromboseprozess modulieren, bilden Blutplättchen die zelluläre Hauptkomponente des Thrombus, und ihre Aktivierung ist für die Thrombusbildung wesentlich. Obwohl die Rolle von Blutplättchen bei Thrombosen tiefgehend charakterisiert wurde, sind die molekularen Mechanismen, die der Blutplättchenaktivierung und fokalen Adhäsion innerhalb menschlicher Koronarthromben zugrunde liegen, die Zusammensetzung, Zeitänderungen des verschließenden Thrombus und seine Wechselwirkung mit den anderen Zellen nicht klar aufgeklärt worden, hauptsächlich aufgrund auf die schwierige Zugänglichkeit des thrombotischen Materials. Obwohl die Thrombusaspiration eine umstrittene Rolle als ergänzende Strategie bei der primären perkutanen Koronarintervention (PCI) für STEMI und NSTEMI spielt, beruht sie auf der Extraktion von okklusiven Thromben durch einen Aspirationskatheter, der im Baum der Koronararterien fortgeschritten ist, und stellt eine einzigartige Gelegenheit zur Gewinnung dar Koronarthromben von Patienten, die an AMI leiden.

Die Definition variabler molekularer Wege, die für die Thrombusbildung gemäß Zeitablauf und Pathophysiologie verantwortlich sind, kann den Weg zu neueren therapeutischen Strategien ebnen.

Hypothese der Studie Der Koronarthrombus erfährt eine signifikante Modifikation gemäß der Pathophysiologie der Entstehung (Erosion, Plaquebruch oder Exposition gegenüber Metallstreben) und des Zeitablaufs ab Symptombeginn.

Die genaue Definition der molekularen Zusammensetzung des Koronarthrombus und seiner proteomischen und metabolomischen Muster kann das Ziel neuerer therapeutischer Strategien identifizieren.

Ziele der Studie sind: die molekulare Zusammensetzung von Koronarthromben bei AMI aufzuklären, phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit der Thrombusbildung auf molekularer Ebene zu verstehen, neue potenzielle Faktoren hervorzuheben, die am Ausbruch der Krankheit beteiligt sind oder mit dem Zeitpunkt der Thrombusbildung zusammenhängen.

Eine aufeinanderfolgende Serie von Patienten, die für ein ACS aufgenommen wurden, entweder mit STEMI und verschlossener infarktbedingter Arterie oder NSTEMI und sichtbarem Thrombus in der schuldigen Arterie, wird als für die Thrombusaspiration geeignet erachtet. PCI wird mit einem Standardverfahren durchgeführt, entweder mit femoralem oder radialem Zugang. Alle Patienten erhalten Acetylsalicylsäure (100 mg täglich) und einen P2Y12-Inhibitor – Clopidogrel (600 mg, dann 75 mg täglich), Prasugrel (60 mg, dann 10 mg täglich) oder Ticagrelor (180 mg täglich). Nach Einlage der arteriellen Schleuse erhält jeder Patient 70 IE/kg Heparin.

Nach der Positionierung des Führungsdrahts über der Läsion wird das Thrombus-Aspirationssystem unter leichtem Saugen vorgeschoben und es werden mehrere Passagen durch die ursächliche Läsion durchgeführt.

Der lyophilisierte Thrombus jedes aufgenommenen Patienten wird einer umfassenden molekularen Charakterisierung in Bezug auf Proteine, Metaboliten (Aminosäuren und Acylcarnitine) und polare Lipide unterzogen.

Polare Metaboliten und Lipide aus Thrombus werden nach einer validierten Methodik extrahiert und analysiert: 5 mg nasser Thrombus werden zu 330 μl einer Methanollösung gegeben, die deuterierte interne Standards von Aminosäuren und Carnitinen und Lyso-Sphingomyelin 100 µg/ml als interne enthält Standard für die Lipidomik. Diese Lösungen werden 50 min bei 45 °C inkubiert und schließlich in zwei Aliquots geteilt. Das erste wird zur Analyse von Aminosäuren und Acyl-Carnitinen nach unserer LC-MS/MS-Methode verwendet, die bereits bei der Analyse von CSF verwendet wird, wie zuvor berichtet. Das zweite Aliquot wird verwendet, um Phospholipide durch LC-MS/MS zu screenen. Die erhaltenen Daten werden mit der Software MarkerLynx und NeoLynx quantifiziert und mit der Software GraphPad Prism, Simca P+ und MetaboAnalyst statistisch untersucht.

Der lyophilisierte Thrombus wird durch das Filter Aided Sample Prep (FASP)-Protokoll verdaut. Dann werden instrumentelle Triplikate für jede Probe von einer nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS-Plattform erfasst, die markierungsfreie Schrotflinten-Proteomik-Experimente durchführt, um exprimierte Proteine ​​wie bereits berichtet zu identifizieren und gleichzeitig zu quantifizieren. Das Ergebnis dieser Studie wird eine Liste exprimierter Proteine ​​während eines Koronarthrombus bei einem akuten Myokardinfarkt sein, die für bioinformatische Analysen verwendet werden kann.

Die Daten werden von einer speziellen Software (Profile Analysis, Bruker, Markerlynx) verarbeitet. Hervorgehobene Metaboliten/Proteine ​​werden anhand der Datenbank und der Fragmentierungsanalyse identifiziert.

Speziell für Metabolomik und Lipidomik werden die Daten verarbeitet, um Peak-Dekonvolution und -Ausrichtung, Entrauschen und Normalisierung der Gesamtionenzahl zu erhalten, um eine Tabelle von Massenpaaren mit zugehörigen relativen Intensitäten für alle detektierten Peaks für jede analysierte Probe zu erhalten. Anschließend wird die Datenmatrix für die multivariate Analyse (PCA; PLS-DA) unter Verwendung von SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB, Umeå, Schweden) verwendet.

Durch Multi-Omics-Forschung und Datenverarbeitung wird ein Panel interessanter Moleküle als Rahmen für jede untersuchte klinische Gruppe verfügbar sein. Diese biologischen Verbindungen werden dann einer In-silico-Analyse unterzogen, um ihre funktionellen Auswirkungen auf die Physiologie und molekulare Homöostase von Koronarthromben bei akutem Myokardinfarkt wiederherzustellen. Um eine solche Metaanalyse der Daten durchzuführen, verwenden wir hauptsächlich Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Durch die Pathways-Analyse und die Gen-Ontologie wird es möglich sein, die Stoffwechselwege und die sekundären Gene/Proteine, die für einen bestimmten Phänotyp gehemmt und/oder stimuliert werden, zu identifizieren und folglich potenzielle Effektormoleküle und/oder pharmakologische Ziele zu klassifizieren.