Proteomisk profilering af koronar trombe ved akut myokardieinfarkt

Iskæmisk hjertesygdom er den førende bidragyder til den verdensomspændende sygdomsbyrde, vurderet på baggrund af handicapjusterede leveår.

ST-elevation myokardieinfarkt (STEMI) er forbundet med en koronar okklusiv trombose hos 90% af patienterne, ikke-ST elevation myokardieinfarkt (NSTEMI) kun i 26% af tilfældene. I denne henseende lægges der stigende opmærksomhed på sammensætningen af ​​koronar thrombus. Ved akut STEMI er indholdet af blodplader og fibrin i den okklusive trombe meget afhængig af iskæmitiden, så man kan udlede, at dette kan have en væsentlig indflydelse på effektiviteten af ​​lægemidler eller anordninger, der anvendes til koronar reperfusion.

Blandt flere cirkulerende celletyper - blodplader, erytrocytter, monocytter og neutrofiler - såvel som plasmamolekyler, der modulerer tromboseprocessen, udgør blodplader den vigtigste cellulære komponent i tromben, og deres aktivering er afgørende for trombedannelse. Selvom blodpladernes rolle i trombose er blevet dybt karakteriseret, er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for blodpladeaktivering og fokal adhæsion i humane koronare tromber, sammensætningen, tidsændringerne af den okkluderende trombe og dens interaktion med de andre celler ikke blevet klart belyst, primært pga. til den vanskelige tilgængelighed til det trombotiske materiale. Trombeaspiration, selvom den har en kontroversiel rolle som en supplerende strategi i primær perkutan koronar intervention (PCI) for STEMI og NSTEMI, er afhængig af ekstraktion af okklusive tromber ved hjælp af et aspirationskateter, avanceret i det koronare arterielle træ og udgør en unik mulighed for at opnå koronar tromber fra patienter, der lider af AMI.

At definere variable molekylære veje, der er ansvarlige for trombedannelse i henhold til tidsforløb og patofysiologi, kan bane vejen for nyere terapeutiske strategier.

Undersøgelsens hypotese Koronar trombe undergår væsentlige ændringer i overensstemmelse med patofysiologien af ​​dannelse (erosion, plaque ruptur eller metalstiver eksponering) og time-lapse fra symptomdebut.

Den nøjagtige definition af den molekylære sammensætning af koronar thrombus og dens proteomiske og metabolomiske mønstre kan identificere målet for nyere terapeutiske strategier.

Formålet med undersøgelsen er: at belyse den molekylære sammensætning af koronar trombe i AMI, at forstå, på molekylært niveau, fænotypiske ændringer relateret til trombedannelse, at fremhæve nye potentielle faktorer involveret i sygdommens opståen eller relateret til tidspunktet for trombedannelse.

En fortløbende række patienter, der er indlagt for en ACS, med enten STEMI og okkluderet infarktrelateret arterie eller NSTEMI og synlig trombe i den skyldige arterie vil blive anset for egnet til trombeaspiration. PCI vil blive udført med en standardprocedure, med enten femoral eller radial adgang. Alle patienter vil få acetylsalicylsyre (100 mg dagligt) og en P2Y12-hæmmer - clopidogrel (600 mg, derefter 75 mg dagligt), prasugrel (60 mg, derefter 10 mg dagligt) eller ticagrelor (180 mg dagligt). Efter indsættelse af arterielskeden vil hver patient modtage 70 IE/kg heparin.

Efter guidewire-positionering på tværs af læsionen, vil trombeaspirationssystemet blive fremført med blidt sug, og flere passager vil blive udført gennem den skyldige læsion.

Den lyofiliserede trombe fra hver indskrevet patient vil gennemgå omfattende molekylær karakterisering med hensyn til proteiner, metabolitter (aminosyrer og acylcarnitiner) og polære lipider.

Polære metabolitter og lipider fra thrombe vil blive ekstraheret og analyseret efter en valideret metode: 5 mg våd thrombe vil blive tilsat til en 330 μL methanolopløsning indeholdende deutererede interne standarder af aminosyrer og carnitiner og lyso-sphingomyelin 100 µg/ml som intern standard for lipidomik. Disse opløsninger vil blive inkuberet ved 45 °C i 50 minutter og til sidst opdelt i to alikvoter. Den første vil blive brugt til at analysere aminosyrer og acyl-carnitiner efter vores LC-MS/MS-metode, der allerede er brugt i analysen af ​​CSF som tidligere rapporteret. Den anden alikvot vil blive anvendt til at screene phospholipider ved LC-MS/MS. Data opnået vil blive kvantificeret ved hjælp af MarkerLynx og NeoLynx software og statistisk undersøgt ved hjælp af GraphPad Prism, Simca P+ og MetaboAnalyst software.

Den lyofiliserede trombe vil blive fordøjet ved hjælp af Filter Aided Sample Prep (FASP) protokol. Derefter vil instrumentelle triplikater blive erhvervet for hver prøve af en platform nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS, der udfører mærkefri shotgun proteomics-eksperimenter for at identificere og samtidig kvantificere udtrykte proteiner som allerede rapporteret. Resultatet af denne undersøgelse vil være en liste over udtrykte proteiner under koronar thrombus ved akut myokardieinfarkt, som kan bruges til bioinformatik analyse.

Data vil blive behandlet af en dedikeret software (Profilanalyse, Bruker, Markerlynx). Fremhævede metabolitter/proteiner vil blive identificeret ved hjælp af database og ved fragmenteringsanalyse.

Specifikt for metabolomics og lipidomics vil dataene blive behandlet for at opnå peak deconvolution og alignment, denoise og Total Ion Count-normalisering for at give en tabel over massepar med tilhørende relative intensiteter for alle de detekterede peaks for hver prøve analyseret. Derefter vil datamatricen blive brugt til multivariat analyse (PCA; PLS-DA) ved brug af SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB, Umeå, Sverige).

Ved multi-omics-forskning og databehandling vil det være tilgængeligt et panel af interessante molekyler som en ramme for hver undersøgt klinisk gruppe. Disse biologiske forbindelser vil derefter blive udsat for en in-silico-analyse for at genopbygge deres funktionelle implikationer i fysiologien og molekylær homeostase af koronar thrombus ved akut myokardieinfarkt. For at udføre en sådan meta-analyse af dataene vil vi hovedsageligt bruge Ingenuity Pathways Analysis (IPA), (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Gennem Pathways-analysen og Gen-ontologien vil det være muligt at identificere de metaboliske veje og de sekundære gener/proteiner, der er hæmmet og/eller stimuleret for en specifik fænotype og følgelig klassificere potentielle effektormolekyler og/eller farmakologiske mål.