Profilo proteomico del trombo coronarico nell'infarto miocardico acuto

La cardiopatia ischemica è il principale contributore al carico mondiale di malattia, valutato sulla base degli anni di vita aggiustati per la disabilità.

L'infarto del miocardio con sopraslivellamento del tratto ST (STEMI) è associato a una trombosi coronarica occlusiva nel 90% dei pazienti, l'infarto del miocardio senza sopraslivellamento del tratto ST (NSTEMI) solo nel 26% dei casi. A questo proposito, viene prestata crescente attenzione alla composizione del trombo coronarico. Nello STEMI acuto, il contenuto di piastrine e fibrina nel trombo occlusivo è altamente dipendente dal tempo di ischemia, quindi si può dedurre che questo può avere un impatto sostanziale sull'efficacia dei farmaci o dei dispositivi utilizzati per la riperfusione coronarica.

Tra i diversi tipi di cellule circolanti - piastrine, eritrociti, monociti e neutrofili - così come le molecole del plasma, che modulano il processo di trombosi, le piastrine costituiscono il principale componente cellulare del trombo e la loro attivazione è essenziale per la formazione del trombo. Sebbene il ruolo delle piastrine nella trombosi sia stato profondamente caratterizzato, i meccanismi molecolari alla base dell'attivazione piastrinica e dell'adesione focale all'interno dei trombi coronarici umani, la composizione, i cambiamenti temporali del trombo occlusivo e la sua interazione con le altre cellule non sono stati chiaramente chiariti, principalmente a causa alla difficile accessibilità al materiale trombotico. L'aspirazione del trombo, pur avendo un ruolo controverso come strategia aggiuntiva nell'intervento coronarico percutaneo primario (PCI) per STEMI e NSTEMI, si basa sull'estrazione di trombi occlusivi mediante un catetere di aspirazione, avanzato nell'albero arterioso coronarico e costituisce un'opportunità unica per ottenere trombi coronarici da pazienti affetti da IMA.

La definizione di percorsi molecolari variabili responsabili della formazione di trombi in base al lasso di tempo e alla fisiopatologia può aprire la strada a nuove strategie terapeutiche.

Ipotesi dello studio Il trombo coronarico subisce modifiche significative in base alla fisiopatologia della formazione (erosione, rottura della placca o esposizione del puntone metallico) e al time-lapse dall'insorgenza dei sintomi.

L'esatta definizione della composizione molecolare del trombo coronarico e dei suoi pattern proteomici e metabolomici può identificare il target di nuove strategie terapeutiche.

Obiettivi dello studio sono: chiarire la composizione molecolare del trombo coronarico nell'IMA, comprendere, a livello molecolare, l'alterazione fenotipica correlata alla formazione del trombo, evidenziare nuovi potenziali fattori coinvolti nell'insorgenza della malattia o correlati al tempo di formazione del trombo.

Una serie consecutiva di pazienti ricoverati per SCA, con STEMI e arteria correlata all'infarto occlusa o NSTEMI e trombo visibile nell'arteria colpevole sarà ritenuta idonea per l'aspirazione del trombo. Il PCI verrà eseguito con una procedura standard, con accesso femorale o radiale. Tutti i pazienti riceveranno acido acetilsalicilico (100 mg al giorno) e un inibitore P2Y12 - clopidogrel (600 mg, poi 75 mg al giorno), prasugrel (60 mg, poi 10 mg al giorno) o ticagrelor (180 mg al giorno). Dopo l'inserimento della guaina arteriosa, ogni paziente riceverà 70 UI/kg di eparina.

Dopo il posizionamento del filo guida attraverso la lesione, il sistema di aspirazione del trombo verrà fatto avanzare con un'aspirazione delicata e verranno eseguiti diversi passaggi attraverso la lesione colpevole.

Il trombo liofilizzato di ciascun paziente arruolato sarà sottoposto ad un'ampia caratterizzazione molecolare in termini di proteine, metaboliti (aminoacidi e acilcarnitine) e lipidi polari.

Metaboliti polari e lipidi dal trombo saranno estratti e analizzati seguendo una metodologia validata: 5 mg di trombo umido saranno aggiunti a 330 μL di soluzione metanolo contenente standard interni deuterati di aminoacidi e carnitine e liso-sfingomielina 100 µg/ml come standard interno standard per la lipidomica. Queste soluzioni saranno incubate a 45 °C per 50 min ed infine divise in due aliquote. Il primo sarà utilizzato per analizzare gli amminoacidi e le acil-carnitine seguendo il nostro metodo LC-MS/MS già utilizzato nell'analisi del CSF come riportato in precedenza. La seconda aliquota sarà impiegata per lo screening dei fosfolipidi mediante LC-MS/MS. I dati ottenuti saranno quantificati utilizzando i software MarkerLynx e NeoLynx e analizzati statisticamente utilizzando i software GraphPad Prism, Simca P+ e MetaboAnalyst.

Il trombo liofilizzato sarà digerito mediante il protocollo FASP (Filter Aided Sample Prep). Quindi, triplicati strumentali saranno acquisiti per ciascun campione da una piattaforma nanoLC-ESI-QTOF-MS/MS che esegue esperimenti di proteomica shotgun label free al fine di identificare e, contemporaneamente, quantificare le proteine ​​espresse come già riportato. Il risultato di questo studio sarà un elenco di proteine ​​espresse durante il trombo coronarico nell'infarto miocardico acuto, che potrà essere utilizzato per l'analisi bioinformatica.

I dati saranno elaborati da un software dedicato (Profile Analysis, Bruker, Markerlynx). I metaboliti/proteine ​​evidenziati saranno identificati mediante database e mediante analisi di frammentazione.

In particolare per la metabolomica e la lipidomica, i dati saranno elaborati per ottenere la deconvoluzione del picco e l'allineamento, il denoise e la normalizzazione del conteggio ionico totale per fornire una tabella di coppie di massa con intensità relative associate per tutti i picchi rilevati per ciascun campione analizzato. Quindi, la matrice di dati verrà utilizzata per l'analisi multivariata (PCA; PLS-DA) utilizzando SIMCA-P + 11.0 (Umetrics AB, Umeå, Svezia).

Attraverso ricerche multi-omiche ed elaborazioni dati, sarà disponibile un pannello di molecole interessanti come quadro per ogni gruppo clinico studiato. Questi composti biologici saranno poi sottoposti ad analisi in-silico per ricostruire le loro implicazioni funzionali nella fisiologia e nell'omeostasi molecolare del trombo coronarico nell'infarto miocardico acuto. Per eseguire tale meta-analisi dei dati utilizzeremo principalmente Ingenuity Pathways Analysis (IPA), (Ingenuity Systems, Mountain View, CA). Attraverso l'analisi dei Pathways e la Gene Ontology sarà possibile identificare le vie metaboliche ei geni/proteine ​​secondari inibiti e/o stimolati per uno specifico fenotipo e conseguentemente classificare potenziali molecole effettrici e/o target farmacologici.