OSの成長と転移を抑制するためのSENP1の阻害

バックグラウンド：

骨肉腫 (OS) は、小児および青年における原発性悪性骨腫瘍の最も一般的なタイプです。 全生存率は、多くの場合肺への転移の発生によって劇的に低下します。 OS などの固形悪性腫瘍は、しばしば低酸素の微小環境を発症し、腫瘍の増殖、転移、治療の失敗、および患者の死亡率に寄与します。 低酸素症やその他の環境条件への適応は、多くの場合、重要なエフェクターの転写後調節の変更に関連しています。 これらの中で、SUMO 化は小さなユビキチン様修飾子 (SUMO) タンパク質によって実行され、Sentrin/SUMO 特異的プロテアーゼ (SENP) によって動的に逆転 (deSUMO 化) されます。 最も特徴的な SENP である SENP1 は、腫瘍形成と腫瘍の進行に関与する複数の腫瘍でアップレギュレートされます。 SENP1 は deSUMO 化を通じて、低酸素誘導因子 1α (HIF1α)、ジンクフィンガー E ボックス結合ホメオボックス 1 (ZEB1)、低酸素への腫瘍細胞の適応に関与する Akt などの重要な調節因子を安定化および活性化する分子ハブとして機能します。微小環境、細胞増殖の誘導、浸潤と移動、およびアポトーシスの阻害により、腫瘍の進行と転移に寄与します。

HIF1αは、低酸素条件下での細胞の適応と生存のための主要な転写調節因子であり、細胞転移の可能性を高めるのに貢献しています。 SENP1を介したHIF1αの脱SUMO化は、プロテアソームによるHIF1αの分解を防ぎ、HIF1αシグナル伝達経路を活性化します。 SENP1 は低酸素状態の OS 細胞で過剰発現し、siRNA を介した SENP1 のサイレンシングは、腫瘍細胞の生存率を低下させ、細胞アポトーシスを促進し、侵襲性を低下させ、上皮間葉転換 (EMT) を阻害します。

ZEB1 は、いくつかの腫瘍の腫瘍形成、進行、浸潤、および転移に関与しています (例: 膠芽腫、前立腺、肺、肝臓、および結腸直腸）。 OS細胞におけるZEB1サイレンシングは、カスパーゼ-3活性の低下、NF-κBおよびiNOS阻害、全体的な細胞増殖の低下、およびアポトーシスの増加につながります。 肝細胞癌 (HCC) 細胞における SENP1 ノックダウンは、ZEB1 を減少させ、EMT を阻害します]。

Akt の過剰活性化は、OS を含む腫瘍の発症と進行に不可欠です。 アストログリオーマ細胞では、SENP1 の siRNA を介した阻害は、その下流の標的である Bcl-xL とサイクリン D1 および p21 のアップレギュレーションの阻害を伴う Akt の低リン酸化に関連しており、細胞周期の停止とアポトーシスの増加につながります。

全体として、これらの研究は、SENP1 がハブとして機能し、その阻害が複数のターゲットに反映されることを示唆しています。 HIF1α、ZEB1、Akt は、酸素正常状態と低酸素状態の両方における腫瘍の進行と転移の重要な要因です。 OSのHIF1αに対するSENP1の影響は知られていますが、SENP1がOSでもZEB1のダウンレギュレーションとAktの不活性化を媒介する可能性があると仮定するのは合理的です。 したがって、新しい SENP1 阻害戦略は、OS の成長と転移をブロックするための潜在的に効果的な治療アプローチです。

SENP1 阻害は、siRNA を介した遺伝子サイレンシングによって達成できます。 ただし、裸の siRNA は非常に不安定であり、リポソームベースの送達システムは効率が悪く、in vitro と in vivo の両方で細胞毒性があります。 SENP1 発現を阻害するための有望なアプローチは、ペプチド核酸 (PNA)、N-(2-アミノエチル) グリシンの繰り返し単位の擬似ペプチド バックボーンによって置き換えられたリン酸バックボーンを持つ核酸塩基オリゴマーによって媒介される遺伝子サイレンシングです。 その不自然なバックボーンのために、PNA はヌクレアーゼとプロテアーゼの両方の活性に対して確実に耐性があり、相補的な DNA または RNA とのより特異的で安定した結合を形成し、効率的かつ持続的なサイレンシング効果を可能にします。 PNA の細胞透過性は非常に低いですが、細胞透過性ペプチド (CPP) と結合させることで効果的に高めることができます。 ここ数年、PNA は癌の診断と治療のための非常に有望なツールとして、そして何よりも、遺伝子治療における安定した遺伝子サイレンシングの有効な候補として浮上してきました。

合理的かつ予備的な研究:

異なる SENP1 mRNA 領域をターゲットとする 3 つの異なる PNA 配列が設計され、テストされます。 ＰＮＡは、ＰＮＡの細胞内送達を効率的に媒介するオクタアルギニン（Ｒ８）ＣＰＰに結合される。 取り込みは、スクランブル配列 R8 およびフルオレセイン (Fl) 結合 PNA (scrPNA-R8-Fl) を使用して研究されます。

設計された PNA-CPP が細胞内に浸透し、標的 SENP1 をサイレンシングする能力の in vitro 特性評価は、OS の細胞株で実施されます。

OS 細胞における PNA-R8 の取り込みを研究するために、異なる浸潤能を持ち、すべて SENP1 を発現する異なる OS 細胞株 (SaOS-2、MG-63、U2OS)、および SENP1 発現のネガティブコントロールとしての初代ヒト骨芽細胞 (hOb) を使用します。利用される。 異なる濃度のscrPNA-R8-Flとのインキュベーション後、フローサイトメトリーによって連続した時点で取り込みが決定され、細胞質局在は蛍光顕微鏡によって確認されます。 R8に結合していないscrPNA-F1は、細胞に入ることが予想されないため、ネガティブコントロールとして機能します。 scrPNA-R8の細胞毒性は、Alamar Blue Cell Viabilityアッセイによってアッセイされます。 さまざまな抗 SENP1 PNA-R8 コンジュゲート (senpPNA-R8) のサイレンシング効果は、正常酸素圧と低酸素圧 (1% O2、5% CO2、および 94% N2) の両方のすべての細胞株でアッセイされます。 senpPNA-R8 を介した SENP1 サイレンシング効率は、RT-qPCR およびウェスタンブロット (WB) によって評価されます。 scrPNA-R8 はネガティブ コントロールとして機能し、SENP1 をターゲットとする siRNA をトランスフェクトした細胞はポジティブ コントロールとして機能します。 この部分では、最も効率的なサイレンシング senpPNA-R8 化合物が選択されます。

OS細胞におけるSENP1阻害の結果として、HIF1αのsenpPNA-R8媒介ダウンレギュレーション、および潜在的にZEB1発現およびAktリン酸化阻害のダウンレギュレーションは、WBによってアッセイされる。 したがって、細胞生存率の低下、遊走と浸潤、アポトーシスの誘導、および EMT 阻害がアッセイされ、hOb の効果と比較されます。 細胞生存率は Alamar Blue アッセイによって決定されますが、アポトーシスは、アネキシン V の染色およびヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーによってアッセイされます。 残留移動と浸潤能力は、それぞれ創傷治癒アッセイとトランスウェル浸潤アッセイによって評価されます。 ビメンチンとN-カドヘリンのダウンレギュレーション、E-カドヘリン、EMTマーカー、およびZEB1（カスパーゼ-3、NF-κB）とAkt（サイクリンD1とBcl-xL）の下流ターゲットのアップレギュレーションは、WBによって決定されます。

OS 細胞株における設計された PNA-CPP の浸透およびサイレンシング能力の in vitro 特性評価は、研究の予備段階です。 PNA-CPP が 3D 組織に浸透し、患者の OS 組織外植片で標的 SENP を沈黙させる能力の ex vivo 分析が続きます。

研究の目的:

このプロジェクトの目的は、OS 細胞株の in vitro モデルで以前に特徴付けられた、新しい強力な PNA ベースの SENP1 阻害剤をテストすることです。

SENP1を介したHIF1α、ZEB1、およびAktの阻害により、酸素正常状態と低酸素状態の両方でOS細胞の生存率と侵襲性を阻害できる、細胞透過性CPPと結合した最も効果的なPNAが、その浸透能力と浸透能力について調査されます。 ex vivo ヒト OS 組織における SENP1 発現をサイレンシングします。

主な目的:

PNA-CPP が、OS 根絶手術中に得られた無駄な生物学的材料に由来する OS の ex vivo 三次元組織に浸透し、組織内で SENP1 を阻害する生物学的機能を発揮する能力を決定すること。

研究デザイン:

この研究では、骨肉腫根絶手術に由来する無駄な生体材料が収集されます。これは、組織学的および分子診断に使用されるもの以外の、除去された腫瘍塊のごく一部を構成します。

一次OSの15人の患者が募集されます。 対象グループは、IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi に入院し、一次 OS の外科的根絶を受ける患者で構成されます。

この研究は、外科医による IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca プロトコル (倫理委員会の承認 n. 29/INT/2017) でも募集できる 18 歳以上の患者に提示されます。 これらの患者は、2 つのインフォームド コンセントに署名します。1 つは BioBanca 用、もう 1 つは PNA-OS 研究用です。

年齢が 18 歳未満の患者は、IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca に加えて追加募集されます。 これらの患者は、法定家庭教師が PNA-OS 研究に関するインフォームド コンセントに署名する場合、研究の資格があると見なされます。

また、BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano) が使用されます。 これらの患者に、この研究に関連する特定のインフォームドコンセントに署名するよう呼びかけるために、あらゆる合理的な努力が行われます。

いくつかの実際的な問題があるため (例: 不適切または生物学的材料の量が少ない) が発生する可能性があるため、15 の完全なサンプルが達成されるまで、追加の患者を募集する可能性を想定しています。

研究は倫理委員会の承認後に開始され、推定期間は36か月で、次のように分割されます。

• 入学時期：24ヶ月
• データ分析：12ヶ月

実験計画：

骨肉腫サンプルにおける PNA-R8 サイレンシング能力の ex vivo 分析。 senpPNA-R8が三次元OS組織に浸透し、そのサイレンシング効果を発揮できるかどうかを調査します。

15 の OS サンプルは、IRCCS Galeazzi BioBanca (倫理委員会承認番号 29/INT/2017) のコンテキストで、または C.C.O.O.R.R. と協力して、新しく募集された患者から収集されます。装備する。

手術自体以外に患者に追加の害を及ぼすことなく、手術に由来する無駄な生体材料のみが使用され、研究には診断目的や収集されたサンプルの遺伝子プロファイリングは含まれません。

OS サンプルは、BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano) を使用して、OS における SENP1 の初期発現レベルを RT-qPCR によって決定します。 このために、サンプルを均質化し、全 RNA を抽出し、RT-qPCR を行って SENP1 発現レベルを測定します。

新たに収集された 15 のうち残りのサンプルは、使用するまで生理的溶液に保存されます。 OS サンプルは 3 mm3 片に切断され、24 マルチウェル培養プレートに配置され、軌道回転下の酸素正常状態および低酸素誘導微小環境の両方で器官型 OS 培養として ex vivo で培養されます [21-23]。 器官型腫瘍組織は、腫瘍細胞が人工マトリックスではなく元の微小環境に囲まれている元の組織の複雑さを維持しており、このシステムは、ex vivo 薬物スクリーニング、薬物取り込みおよび分子プロセスの研究に特に有利です。 OS培養物はsenpPNA-R8で処理され、ナイーブおよびPNA処理サンプルにおけるSENP1発現は、パラフィン包埋切片でのRT-qPCRおよび免疫組織化学によって決定されます。 PNA-R8 が OS サンプルの低酸素コア内に浸透する能力を評価します。scrPNA-R8-Fl とのインキュベーション後、切片を直ちに凍結し (-80°C)、処理し、免疫蛍光法で分析します。

サンプルは分析され、試験の全期間中、Istituto Ortopedico Galeazzi の Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare で保存されます。 研究の最後に、すべての残留物は破壊されます。