OS 성장 및 전이 억제를 위한 SENP1의 억제

배경:

골육종(OS)은 소아 및 청소년에서 가장 흔한 유형의 원발성 악성 골종양입니다. 전체 생존율은 전이, 종종 폐의 발달로 인해 극적으로 감소합니다. OS와 같은 고형 악성 종양은 종종 종양 성장, 전이, 치료 실패 및 환자 사망에 기여하는 저산소 미세 환경을 개발합니다. 다른 환경 조건뿐만 아니라 저산소증에 대한 적응은 종종 주요 이펙터의 전사 후 조절의 수정과 관련이 있습니다. 이 중에서 SUMOylation은 small ubiquitin-like modifier(SUMO) 단백질에 의해 수행되며 Sentrin/SUMO-specific proteases(SENPs)에 의해 동적으로 역전됩니다(deSUMOylation). 가장 특징적인 SENP인 SENP1은 종양 형성 및 종양 진행에 관여하는 여러 종양에서 상향 조절됩니다. deSUMOylation을 통해 SENP1은 HIF1α(hypoxia-inducible factor 1α), ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1), 저산소증에 대한 종양 세포 적응을 담당하는 Akt와 같은 주요 조절 인자를 안정화하고 활성화하는 분자 허브 역할을 합니다. 미세 환경, 세포 증식, 침입 및 이동 유도, 세포 사멸 억제, 따라서 종양 진행 및 전이에 기여합니다.

HIF1α는 저산소 상태에서 세포 적응 및 생존을 위한 마스터 전사 조절인자이며 세포 전이 가능성을 높이는 데 기여합니다. SENP1 매개 HIF1α deSUMOylation은 프로테아좀에 의한 HIF1α 분해를 방지하여 HIF1α 신호 전달 경로를 활성화합니다. SENP1은 저산소 상태에서 OS 세포에서 과발현되며, SENP1의 siRNA 매개 침묵은 종양 세포 생존력을 감소시키고, 세포 사멸을 촉진하며, 침입성을 감소시키고, 상피-중간엽 전이(EMT)를 억제합니다.

ZEB1은 여러 종양(예: 교모세포종, 전립선, 폐, 간 및 결장직장). OS 세포에서 ZEB1 침묵은 caspase-3 활성 감소, NF-κB 및 iNOS 억제, 전반적인 세포 증식 감소 및 세포 사멸 증가로 이어집니다. 간세포 암종(HCC) 세포에서 SENP1 녹다운은 ZEB1을 감소시키고 EMT를 억제합니다].

Akt 과활성화는 OS를 포함한 종양의 발병 및 진행에 필수적입니다. astroglioma 세포에서 SENP1의 siRNA 매개 억제는 Akt 저인산화와 관련이 있으며 Bcl-xL 및 cyclinD1 및 p21 상향 조절의 억제와 함께 세포주기 정지 및 세포 사멸 증가로 이어집니다.

전체적으로, 이러한 연구는 SENP1이 그 억제가 여러 표적에 반영되는 허브 역할을 한다는 것을 시사합니다. HIF1α, ZEB1, Akt는 정상 산소 상태와 저산소 상태 모두에서 종양 진행 및 전이의 핵심 요소입니다. SENP1이 OS에서 HIF1α에 미치는 영향은 알려져 있지만 SENP1이 OS에서도 ZEB1 하향 조절 및 Akt 비활성화를 매개할 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다. 따라서, 새로운 SENP1 억제 전략은 OS 성장 및 전이를 차단하는 잠재적으로 효과적인 치료 접근법입니다.

SENP1 억제는 siRNA에 의해 매개되는 유전자 침묵에 의해 달성될 수 있습니다. 그러나 네이키드 siRNA는 매우 불안정하고 리포좀 기반 전달 시스템은 효율성이 낮고 시험관 내 및 생체 내 모두에서 세포 독성이 있습니다. SENP1 발현 억제를 위한 유망한 접근법은 N-(2-아미노에틸) 글리신의 반복 단위의 슈도펩티드 백본으로 대체된 포스페이트 백본이 있는 핵염기 올리고머인 펩티드 핵산(PNA)에 의해 매개되는 유전자 침묵입니다. 부자연스러운 백본으로 인해 PNA는 뉴클레아제 및 프로테아제 활동 모두에 확실히 저항성이 있으며 상보적인 DNA 또는 RNA와 보다 특이적이고 안정적인 결합을 형성하여 효율적이고 지속적인 침묵 효과를 허용합니다. PNA 세포 투과성은 매우 열악하지만 CPP(cell-penetrating peptides)와의 접합에 의해 효과적으로 향상될 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 PNA는 암 진단 및 치료를 위한 유망한 도구로 부상했으며 무엇보다도 유전자 치료에서 안정적인 유전자 침묵을 위한 효과적인 후보로 부상했습니다.

합리적이고 예비적인 연구:

서로 다른 SENP1 mRNA 영역을 표적으로 하는 3개의 서로 다른 PNA 서열을 설계하고 테스트할 것입니다. PNA는 PNA의 세포내 전달을 효율적으로 매개하는 옥타-아르기닌(R8) CPP에 접합될 것입니다. 흡수는 스크램블드 시퀀스 R8- 및 플루오레세인(Fl)-접합 PNA(scrPNA-R8-Fl)로 연구될 것입니다.

설계된 PNA-CPP가 세포내로 침투하고 표적 SENP1을 침묵시키는 능력의 시험관내 특성화가 OS의 세포주에서 수행될 것이다.

OS 세포에서 PNA-R8 흡수를 연구하기 위해, 서로 다른 침습 가능성을 갖고 SENP1을 모두 발현하는 서로 다른 OS 세포주(SaOS-2, MG-63, U2OS) 및 SENP1 발현에 대한 음성 대조군으로서 일차 인간 골아세포(hOb)를 연구할 것입니다. 사용할 수 있습니다. 상이한 농도에서 scrPNA-R8-F1과 함께 인큐베이션한 후, 흡수는 유동 세포측정법에 의해 연속적인 시점에서 결정되는 반면, 세포질 국소화는 형광 현미경법에 의해 확인될 것이다. R8에 접합되지 않은 scrPNA-F1은 세포에 들어갈 것으로 예상되지 않기 때문에 음성 대조군으로 기능할 것입니다. scrPNA-R8의 세포독성은 Alamar Blue Cell Viability 분석으로 분석됩니다. 상이한 항-SENP1 PNA-R8 접합체(senpPNA-R8)의 침묵 효과는 정상 산소 상태 및 저산소 상태(1% O2, 5% CO2 및 94% N2)의 모든 세포주에서 분석될 것이다. senpPNA-R8 매개 SENP1 침묵 효율은 RT-qPCR 및 웨스턴 블롯(WB)에 의해 평가됩니다. scrPNA-R8은 음성 대조군 역할을 하는 반면, SENP1을 표적으로 하는 siRNA로 형질감염된 세포는 양성 대조군 역할을 할 것입니다. 이 부분에서 가장 효율적인 사일런싱 senpPNA-R8 화합물이 선택됩니다.

OS 세포에서 SENP1 억제의 결과로서 HIF1α의 senpPNA-R8 매개 하향 조절 및 잠재적으로 ZEB1 발현 및 Akt 인산화 억제가 WB에 의해 분석될 것이다. 따라서 감소된 세포 생존력, 이동 및 침입, 아폽토시스 유도 및 EMT 억제가 검정되고 hOb에서의 효과와 비교될 것이다. 세포 생존력은 Alamar Blue 분석에 의해 결정되는 반면, 아폽토시스는 아넥신 V의 염색 및 요오드화 프로피디움으로 유세포분석법에 의해 분석될 것입니다. 잔류 이동 및 침습 능력은 각각 상처 치유 분석 및 트랜스웰 침습 분석에 의해 평가될 것이다. vimentin 및 N-cadherin의 하향 조절 및 E-cadherin, EMT 마커 및 ZEB1(caspase-3, NF-κB) 및 Akt(cyclinD1 및 Bcl-xL)의 다운스트림 표적의 상향 조절은 WB에 의해 결정됩니다.

OS 세포주에서 설계된 PNA-CPP의 침투 및 침묵 능력의 시험관 내 특성화는 연구의 예비 단계입니다. PNA-CPP가 3D 조직에 침투하여 환자의 OS 조직 이식편에서 표적 SENP를 침묵시키는 능력에 대한 생체외 분석이 뒤따를 것입니다.

연구 목적:

이 프로젝트의 목표는 이전에 OS 세포주의 체외 모델에서 특성화된 새로운 강력한 PNA 기반 SENP1 억제제를 테스트하는 것입니다.

HIF1α, ZEB1 및 Akt의 SENP1 매개 억제를 통해 정상 산소 상태 및 저산소 상태 모두에서 OS 세포 생존 및 침습성을 억제할 수 있는 세포 투과성 CPP와 접합된 가장 효과적인 PNA는 침투 및 생체 외 인간 OS 조직에서 SENP1 발현을 침묵시킵니다.

기본 목표:

PNA-CPP가 OS 박멸 수술 중에 얻은 폐 생물학적 물질로부터 유래된 OS의 체외 삼차원 조직으로 침투하고 조직 내에서 SENP1을 억제하는 생물학적 기능을 발휘하는 능력을 결정합니다.

연구 설계:

이 연구를 위해 조직학적 및 분자적 진단에 사용된 것 외에 제거된 종양 덩어리의 작은 비율만을 포함하는 골육종 박멸 수술에서 파생된 폐기물 생물학적 물질을 수집할 것입니다.

일차 OS를 가진 15명의 환자가 모집될 것입니다. 대상 그룹은 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi에 입원한 환자로 원발성 OS의 외과적 박멸을 받게 됩니다.

이 연구는 외과의가 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca 프로토콜(윤리 위원회 승인 n. 29/INT/2017)에서도 모집할 수 있는 18세 이상의 환자에게 제공될 것입니다. 이 환자들은 BioBanca에 대한 동의서와 PNA-OS 연구에 대한 동의서에 서명합니다.

18세 미만의 환자는 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca 외에 추가로 모집됩니다. 이러한 환자는 법률 교사가 PNA-OS 연구와 관련된 정보에 입각한 동의서에 서명하는 경우 연구에 적격한 것으로 간주됩니다.

또한 BioRep Service-Provider(BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano)가 사용됩니다. 이 연구와 관련된 특정 정보에 입각한 동의서에 서명하도록 이러한 환자에게 전화하기 위해 모든 합당한 노력을 기울일 것입니다.

몇 가지 실질적인 문제(예: 부적합 또는 소량의 생물학적 물질)이 발생할 수 있으므로 15개의 완전한 샘플이 달성될 때까지 추가 환자를 모집할 가능성을 구상하고 있습니다.

연구는 윤리위원회의 승인 후 시작되며 예상 기간은 36개월이며 다음과 같이 나뉩니다.

• 등록 시기: 24개월
• 데이터 분석: 12개월

실험적 설계:

골육종 샘플에서 PNA-R8 침묵화 능력의 생체 외 분석. 우리는 senpPNA-R8이 3차원 OS 조직에 침투하여 침묵 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 조사할 것입니다.

15개의 OS 샘플은 IRCCS Galeazzi BioBanca(윤리 위원회 승인 n. 29/INT/2017)의 맥락에서 또는 C.C.O.O.R.R.와 공동으로 새로 모집된 환자로부터 수집됩니다. 갖추게 하다.

수술 자체 외에 환자에게 추가적인 피해 없이 수술에서 파생된 낭비되는 생물학적 물질만 사용되며, 연구는 수집된 샘플의 진단 목적이나 유전적 프로파일링을 포함하지 않습니다.

OS 샘플은 이미 BioRep Service-Provider(BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano)는 RT-qPCR에 의해 OS에서 SENP1의 초기 발현 수준을 결정하는 데 사용될 것입니다. 이를 위해 샘플을 균질화하고 총 RNA를 추출한 다음 RT-qPCR을 수행하여 SENP1 발현 수준을 분석합니다.

새로 채취한 15개 시료 중 나머지 시료는 사용 전까지 생리액에 보관합니다. OS 샘플은 3 mm3 조각으로 절단되고 24-멀티웰 배양 플레이트에 배치되며 궤도 회전 하에서 정상 산소 상태 및 저산소증 유발 미세 환경 모두에서 기관형 OS 배양으로 체외에서 배양됩니다[21-23]. Organotypic 종양 조직은 종양 세포가 인공 매트릭스가 아닌 원래의 미세 환경으로 둘러싸여 있는 원래 조직의 복잡성을 유지하며 이 시스템은 약물 흡수 및 분자 과정을 연구하기 위한 생체 외 약물 스크리닝에 특히 유리합니다. OS 배양물은 senpPNA-R8로 처리될 것이며, 나이브 및 PNA 처리된 샘플에서의 SENP1 발현은 RT-qPCR 및 파라핀 포매 섹션의 면역조직화학에 의해 결정될 것입니다. PNA-R8이 OS 샘플의 저산소 코어 내로 침투하는 능력을 평가할 것입니다: scrPNA-R8-F1과 함께 인큐베이션한 후 절편을 즉시 동결(-80°C)하고 면역형광으로 처리 및 분석합니다.

샘플은 전체 연구 기간 동안 Istituto Ortopedico Galeazzi의 Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare에서 분석 및 보관됩니다. 연구가 끝나면 모든 잔여 물질은 파괴됩니다.