抑制 SENP1 以抑制 OS 生长和转移

背景：

骨肉瘤 (OS) 是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤。 转移（通常是肺部）的发展会显着降低总体存活率。 实体恶性肿瘤，如 OS，通常会形成缺氧微环境，这会导致肿瘤生长、转移、治疗失败和患者死亡。 对缺氧以及其他环境条件的适应通常与关键效应子转录后调控的改变有关。 其中，SUMOylation 由小泛素样修饰剂 (SUMO) 蛋白进行，并被 Sentrin/SUMO 特异性蛋白酶 (SENP) 动态逆转（去SUMOylation）。 SENP1 是最具特征的 SENP，在参与肿瘤发生和肿瘤进展的多种肿瘤中上调。 通过 deSUMOylation，SENP1 充当稳定和激活关键调节因子的分子中枢，例如缺氧诱导因子 1α (HIF1α)、锌指 E-box 结合同源框 1 (ZEB1) 和负责肿瘤细胞适应缺氧的 Akt微环境，诱导细胞增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的进展和转移。

HIF1α 是缺氧条件下细胞适应和存活的主要转录调节因子，有助于增强细胞转移潜能。 SENP1 介导的 HIF1α 去SUMO化可防止 HIF1α 被蛋白酶体降解，从而激活 HIF1α 信号通路。 SENP1 在低氧条件下在 OS 细胞中过表达，siRNA 介导的 SENP1 沉默降低肿瘤细胞活力，促进细胞凋亡，降低侵袭性，并抑制上皮 - 间质转化（EMT）。

ZEB1 参与多种肿瘤的发生、进展、侵袭和转移（例如 胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺、肝和结直肠癌）。 OS 细胞中的 ZEB1 沉默导致 caspase-3 活性降低、NF-κB 和 iNOS 抑制、总体细胞增殖减少和细胞凋亡增加。 肝细胞癌 (HCC) 细胞中的 SENP1 敲低会降低 ZEB1 并抑制 EMT]。

Akt 过度激活对于肿瘤（包括 OS）的发生和发展至关重要。 在星形胶质瘤细胞中，siRNA 介导的 SENP1 抑制与 Akt 低磷酸化相关，伴随着其下游靶标 Bcl-xL 和细胞周期蛋白 D1 和 p21 上调的抑制，导致细胞周期停滞和细胞凋亡增加。

总而言之，这些研究表明 SENP1 充当一个枢纽，其抑制作用反映在多个目标上，其中一些目标，即 HIF1α、ZEB1、Akt 是常氧和缺氧条件下肿瘤进展和转移的关键因素。 虽然已知 SENP1 对 OS 中的 HIF1α 的影响，但可以合理地假设 SENP1 可能在 OS 中介导 ZEB1 下调和 Akt 失活。 因此，新的 SENP1 抑制策略是阻断 OS 生长和转移的潜在有效治疗方法。

SENP1 抑制可以通过 siRNA 介导的基因沉默来实现。 然而，裸露的 siRNA 非常不稳定，基于脂质体的递送系统在体外和体内都效率低下且具有细胞毒性。 抑制 SENP1 表达的一种有前途的方法是由肽核酸 (PNA) 介导的基因沉默，PNA 是磷酸盐骨架被 N-(2-氨基乙基) 甘氨酸重复单元的假肽骨架取代的核碱基寡聚体。 由于其非天然骨架，PNA 对核酸酶和蛋白酶活性具有明确的抗性，与互补 DNA 或 RNA 形成更特异和稳定的结合，从而实现有效和持久的沉默效果。 虽然 PNA 细胞通透性很差，但可以通过与细胞穿透肽 (CPP) 结合来有效增强。 在过去几年中，PNA 已成为真正有前途的癌症诊断和治疗工具，最重要的是，它是基因治疗中稳定基因沉默的有效候选者。

理性初步研究：

将设计和测试针对不同 SENP1 mRNA 区域的 3 种不同 PNA 序列。 PNA 将与八精氨酸 (R8) CPP 偶联，从而有效地介导 PNA 的细胞内递送。 将使用乱序序列 R8 和荧光素 (Fl) 缀合的 PNA (scrPNA-R8-Fl) 研究摄取。

设计的 PNA-CPP 穿透细胞内和沉默目标 SENP1 的能力的体外表征将在 OS 细胞系中进行。

为了研究 PNA-R8 在 OS 细胞中的摄取，具有不同侵袭潜力且均表达 SENP1 的不同 OS 细胞系（SaOS-2、MG-63、U2OS），以及原代人成骨细胞（hOb）作为 SENP1 表达的阴性对照，将使用。 在与不同浓度的 scrPNA-R8-Fl 孵育后，将通过流式细胞术在连续时间点确定摄取，而细胞质定位将通过荧光显微镜确认。 未与 R8 结合的 scrPNA-F1 将用作阴性对照，因为它预计不会进入细胞。 scrPNA-R8 的细胞毒性将通过 Alamar Blue 细胞活力测定进行测定。 不同抗 SENP1 PNA-R8 偶联物 (senpPNA-R8) 的沉默效果将在含氧量正常和缺氧（1% O2、5% CO2 和 94% N2）的所有细胞系中进行测定。 senpPNA-R8 介导的 SENP1 沉默效率将通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹 (WB) 进行评估。 scrPNA-R8 将用作阴性对照，而用靶向 SENP1 的 siRNA 转染的细胞将用作阳性对照。 在这一部分中，将选择最有效的沉默 senpPNA-R8 化合物。

WB 将检测 senpPNA-R8 介导的 HIF1α 下调，以及 ZEB1 表达和 Akt 磷酸化抑制的潜在下调，这是 OS 细胞中 SENP1 抑制的结果。 因此，将测定降低的细胞活力、迁移和侵袭、细胞凋亡的诱导和EMT抑制，并与hOb中的作用进行比较。 细胞生存力将通过 Alamar Blue 测定来确定，而细胞凋亡将通过流式细胞术通过膜联蛋白 V 和碘化丙啶染色来测定。 残留迁移和侵袭能力将分别通过伤口愈合试验和transwell侵袭试验进行评估。 波形蛋白和 N-钙粘蛋白的下调和 E-钙粘蛋白、EMT 标记物以及 ZEB1（caspase-3、NF-κB）和 Akt（cyclinD1 和 Bcl-xL）下游靶标的下调将由 WB 确定。

设计的 PNA-CPP 在 OS 细胞系中的渗透和沉默能力的体外表征是研究的初步步骤。 随后将对 PNA-CPP 穿透 3D 组织并使患者 OS 组织外植体中的目标 SENP 沉默的能力进行离体分析。

研究目的：

该项目的目的是测试一种新的基于 PNA 的强大 SENP1 抑制剂，该抑制剂以前在 OS 细胞系的体外模型中进行过表征。

最有效的 PNA 与细胞渗透性 CPP 结合，能够通过 SENP1 介导的 HIF1α、ZEB1 和 Akt 抑制，在常氧和缺氧条件下抑制 OS 细胞的活力和侵袭性，将研究其渗透和渗透能力。沉默 SENP1 在离体人类 OS 组织中的表达。

主要目标：

确定 PNA-CPP 渗透到 OS 的离体三维组织中的能力，该组织来源于 OS 根除手术期间获得的废弃生物材料，并发挥其抑制组织内 SENP1 的生物学功能。

学习规划：

对于这项研究，将收集来自骨肉瘤根除手术的废弃生物材料，除了用于组织学和分子诊断的肿瘤块外，这些材料仅占切除肿瘤块的一小部分。

将招募 15 名原发性 OS 患者。 目标群体将包括在 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi 住院的患者，他们将接受手术根除原发性 OS。

该研究将提交给年龄≥18 岁的患者，这些患者也可以由外科医生在 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca 协议（伦理委员会批准号 29/INT/2017）中招募。 这些患者将签署两份知情同意书：一份用于 BioBanca，一份用于 PNA-OS 研究。

除了 IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca 之外，还将招募年龄 <18 岁的患者。 如果法定导师将签署与 PNA-OS 研究相关的知情同意书，则这些患者将被视为符合研究条件。

还有 BioBanca 中已经存在的 OS 样本，作为冷冻样本保存在 BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l.) 的液氮中。 Via Olgettina 60, 20132, Milano) 将被使用。 将尽一切合理努力让这些患者签署与本研究相关的特定知情同意书。

由于几个实际问题（例如 不合适或少量生物材料）可能会发生，我们设想有可能招募更多患者，直到获得 15 个完整样本。

本研究将在伦理委员会批准后开始，预计持续时间为36个月，分为以下几部分：

• 入学时间：24个月
• 数据分析：12个月

实验设计：

骨肉瘤样本中 PNA-R8 沉默能力的离体分析。 我们将研究 senpPNA-R8 是否能够渗透到三维 OS 组织中并发挥其沉默作用。

将与 C.C.O.O.R.R. 合作，在 IRCCS Galeazzi BioBanca（伦理委员会批准号 29/INT/2017）的背景下或从新招募的患者中收集 15 个 OS 样本。装备。

仅使用来自手术的废弃生物材料，除手术本身外，不会对患者造成任何额外伤害，并且该研究不涉及任何诊断目的或所收集样本的基因分析。

OS 样品，已经存在于 BioBanca 中，作为冷冻样品保存在 BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l.) 的液氮中。 Via Olgettina 60, 20132, Milano)，将用于通过 RT-qPCR 确定 OS 中 SENP1 的初始表达水平。 为此，样品将被均质化，提取总 RNA，并进行 RT-qPCR 检测 SENP1 表达水平。

15 个新鲜采集的样本中的剩余样本将保存在生理溶液中直至使用。 将 OS 样品切成 3 mm3 的小块，置于 24 孔培养板中，并在轨道旋转下在常氧和缺氧诱导的微环境中作为器官型 OS 培养物离体培养 [21-23]。 器官型肿瘤组织保持原始组织的复杂性，肿瘤细胞被其原始微环境而不是人工基质包围，该系统特别有利于体外药物筛选，研究药物摄取和分子过程。 OS 培养物将用 senpPNA-R8 处理，并且 SENP1 在幼稚和 PNA 处理的样品中的表达将通过石蜡包埋切片中的 RT-qPCR 和免疫组织化学来确定。 将评估 PNA-R8 穿透 OS 样品缺氧核心的能力：与 scrPNA-R8-Fl 孵育后，切片将立即冷冻（-80°C），通过免疫荧光进行处理和分析。

在整个研究期间，样本将在 Istituto Ortopedico Galeazzi 的 Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare 进行分析和储存。 在研究结束时，所有残留材料都将被销毁。