Inibição de SENP1 para a supressão do crescimento e metástase OS

Fundo:

O osteossarcoma (OS) é o tipo mais comum de tumor ósseo maligno primário em crianças e adolescentes. A taxa de sobrevida global é drasticamente reduzida pelo desenvolvimento de metástases, muitas vezes pulmonares. Tumores malignos sólidos, como OS, geralmente desenvolvem um microambiente hipóxico, que contribui para o crescimento do tumor, metástase, falha do tratamento e mortalidade do paciente. A adaptação à hipóxia, bem como a outras condições ambientais, é frequentemente associada a modificações na regulação pós-transcricional dos principais efetores. Entre estes, a SUMOilação é realizada por pequenas proteínas modificadoras do tipo ubiquitina (SUMO) e é revertida dinamicamente (desSUMOilação) por proteases específicas de Sentrina/SUMO (SENPs). O SENP1, o SENP melhor caracterizado, é regulado positivamente em múltiplos tumores estando envolvido na tumorigênese e progressão tumoral. Por meio da deSUMOilação, o SENP1 atua como um hub molecular que estabiliza e ativa os principais fatores reguladores, como o fator induzível por hipóxia 1α (HIF1α), o dedo de zinco E-box binding homeobox 1 (ZEB1) e Akt, responsável pela adaptação das células tumorais à hipóxia. microambiente, indução da proliferação celular, invasão e migração e inibição da apoptose, contribuindo assim para a progressão tumoral e metástase.

O HIF1α é o principal regulador transcricional para adaptação celular e sobrevivência em condições hipóxicas, e contribui para aumentar o potencial metastático celular. A deSUMOilação do HIF1α mediada por SENP1 previne a degradação do HIF1α pelo proteassoma, ativando assim a via de sinalização do HIF1α. O SENP1 é superexpresso em células OS sob condição hipóxica e o silenciamento de SENP1 mediado por siRNA diminui a viabilidade das células tumorais, promove a apoptose celular, reduz a invasividade e inibe a transição epitelial-mesenquimal (EMT).

O ZEB1 está envolvido na tumorigênese, progressão, invasão e metástases em vários tumores (p. glioblastoma, próstata, pulmão, fígado e colorretal). O silenciamento de ZEB1 em células OS leva a uma redução da atividade da caspase-3, inibição de NF-κB e iNOS, redução geral da proliferação celular e aumento da apoptose. O knockdown de SENP1 em células de carcinoma hepatocelular (HCC) diminui ZEB1 e inibe EMT].

A hiperativação de Akt é essencial para o aparecimento e progressão de tumores, incluindo OS. Em células de astroglioma, a inibição de SENP1 mediada por siRNA está associada à hipofosforilação de Akt acompanhada pela inibição de seus alvos a jusante Bcl-xL e regulação positiva de ciclinaD1 e p21, levando à parada do ciclo celular e aumento da apoptose.

Ao todo, esses estudos sugerem que o SENP1 atua como um hub cuja inibição reflete em múltiplos alvos, alguns dos quais, ou seja, HIF1α, ZEB1, Akt, são fatores-chave na progressão do tumor e metástase em normóxia e hipóxia. Embora seja conhecido o efeito de SENP1 em HIF1α em OS, é razoável supor que SENP1 possa mediar a regulação negativa de ZEB1 e a inativação de Akt também em OS. Assim, novas estratégias de inibição de SENP1 são abordagens terapêuticas potencialmente eficazes para bloquear o crescimento e a metástase do OS.

A inibição de SENP1 pode ser conseguida por silenciamento de genes mediado por siRNAs. No entanto, os siRNAs nus são altamente instáveis ​​e os sistemas de entrega baseados em lipossomas são pouco eficientes e citotóxicos in vitro e in vivo. Uma abordagem promissora para a inibição da expressão de SENP1 é o silenciamento de genes mediado por ácidos nucléicos peptídicos (PNA), oligômeros de nucleobase com o esqueleto fosfato substituído por um esqueleto pseudopeptídico de unidades repetidas de N-(2-aminoetil) glicina. Devido à sua estrutura não natural, os PNAs são definitivamente resistentes às atividades de nuclease e protease, formam uma ligação mais específica e estável com o DNA ou RNA complementar, permitindo um efeito silenciador eficiente e persistente. Embora a permeabilidade celular do PNA seja muito baixa, ela pode ser efetivamente aumentada por sua conjugação com peptídeos de penetração celular (CPP). Nos últimos anos, os PNA surgiram como ferramentas realmente promissoras para o diagnóstico e terapia do câncer e, acima de tudo, como candidatos eficazes para o silenciamento estável de genes na terapia gênica.

Estudo racional e preliminar:

3 diferentes sequências de PNA direcionadas a diferentes regiões de mRNA de SENP1 serão projetadas e testadas. Os PNAs serão conjugados a um CPP de octa-arginina (R8) que medeia eficientemente a entrega intracelular de PNAs. A captação será estudada com um PNA conjugado com R8 e fluoresceína (Fl) de sequência embaralhada (scrPNA-R8-Fl).

Uma caracterização in vitro da capacidade do PNA-CPP projetado de penetrar intracelularmente e silenciar o alvo SENP1 será realizada em linhagens celulares de OS.

Para estudar a captação de PNA-R8 em células OS, diferentes linhagens de células OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) com diferentes potenciais invasivos e todas expressando SENP1, e osteoblastos humanos primários (hOb) como controle negativo para expressão de SENP1, serão ser usado. Após a incubação com scrPNA-R8-Fl em diferentes concentrações, a absorção será determinada em pontos de tempo consecutivos por citometria de fluxo, enquanto a localização citoplasmática será confirmada por microscopia de fluorescência. Um scrPNA-Fl não conjugado com R8 funcionará como um controle negativo, pois não é esperado que entre na célula. A citotoxicidade do scrPNA-R8 será avaliada pelo ensaio Alamar Blue Cell Viability Assay. A eficácia silenciadora dos diferentes conjugados anti-SENP1 PNA-R8 (senpPNA-R8) será avaliada em todas as linhagens celulares tanto em normóxia quanto em hipóxia (1% O2, 5% CO2 e 94% N2). A eficiência do silenciamento de SENP1 mediado por senpPNA-R8 será avaliada por RT-qPCR e western-blot (WB). O scrPNA-R8 servirá como controle negativo, enquanto as células transfectadas com siRNA visando SENP1 servirão como controle positivo. Nesta parte será selecionado o composto senpPNA-R8 silenciador mais eficiente.

A regulação negativa de HIF1α mediada por senpPNA-R8, e potencialmente da expressão de ZEB1 e inibições da fosforilação de Akt, como consequência da inibição de SENP1 em células OS, será avaliada por WB. Assim, a viabilidade celular reduzida, migração e invasão, indução de apoptose e inibição de EMT serão ensaiadas e comparadas com os efeitos em hOb. A viabilidade celular será determinada pelo ensaio Alamar Blue, enquanto a apoptose será avaliada por citometria de fluxo por coloração de Anexina V e com iodeto de propídio. A migração residual e capacidade de invasão serão avaliadas por ensaio de cicatrização de feridas e ensaio de invasão transwell, respectivamente. Downregulation de vimentina e N-caderina e upregulation de E-caderina, marcadores EMT e dos alvos downstream de ZEB1 (caspase-3, NF-κB) e Akt, (cyclinD1 e Bcl-xL) serão determinados por WB.

A caracterização in vitro da capacidade de penetração e silenciamento do PNA-CPP projetado em linhagens de células OS é a etapa preliminar do estudo. Uma análise ex vivo da capacidade do PNA-CPP de penetrar em um tecido 3D e silenciar o alvo SENP em um explante de tecido OS de pacientes seguirá.

Objetivos do estudo:

O objetivo deste projeto é testar um novo inibidor de SENP1 baseado em PNA, previamente caracterizado em um modelo in vitro de linhagens de células OS.

O PNA mais eficaz, conjugado com um CPP permeável às células, capaz de inibir a viabilidade e invasividade das células OS tanto na normóxia quanto na hipóxia por meio da inibição de HIF1α, ZEB1 e Akt mediada por SENP1, será investigado quanto à sua capacidade de penetrar e silenciar a expressão de SENP1 em tecidos OS humanos ex vivo.

Objetivo primário:

Determinar a capacidade do PNA-CPP de penetrar em um tecido tridimensional ex vivo de OS, derivado de material biológico desperdiçado obtido durante a cirurgia de erradicação de OS, e de exercer sua função biológica de inibir a SENP1 no tecido.

Design de estudo:

Para este estudo, será coletado material biológico residual derivado da cirurgia de erradicação do osteossarcoma, que compreende apenas uma pequena proporção da massa tumoral removida, além daquela usada para diagnóstico histológico e molecular.

Serão recrutados 15 pacientes com OS primário. O grupo-alvo será composto por pacientes internados no IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, que serão submetidos à erradicação cirúrgica do OS primário.

O estudo será apresentado a pacientes com idade ≥18 anos que possam ser recrutados também no protocolo IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (aprovação do comitê de ética n. 29/INT/2017) pelo cirurgião. Esses pacientes assinarão dois Consentimento Livre e Esclarecido: um para o BioBanca e outro para o estudo PNA-OS.

Pacientes com idade <18 anos serão adicionalmente recrutados além do IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca. Esses pacientes serão considerados elegíveis para o estudo se o responsável legal assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido relativo ao estudo PNA-OS.

Também amostras de OS já existentes no BioBanca como amostras congeladas preservadas em nitrogênio líquido no BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano). Todo esforço razoável será feito para chamar esses pacientes para assinar um consentimento informado específico relativo a este estudo.

Uma vez que várias questões práticas (p. inadequação ou baixa quantidade de material biológico), vislumbramos a possibilidade de recrutar pacientes adicionais até a obtenção de 15 amostras completas.

O Estudo terá início após aprovação do Comitê de Ética e a duração estimada é de 36 meses, assim divididos:

• Prazo para inscrição: 24 meses
• Análise de dados: 12 meses

Design experimental:

Análise ex vivo da capacidade de silenciamento do PNA-R8 em amostras de osteossarcoma. Investigaremos se o senpPNA-R8 é capaz de penetrar em um tecido OS tridimensional e exercer seu efeito silenciador.

Serão recolhidas 15 amostras de SO no contexto do IRCCS Galeazzi BioBanca (aprovação da comissão de ética n. 29/INT/2017) ou de doentes recém-recrutados, em colaboração com o C.C.O.O.R.R. equipar.

Somente material biológico desperdiçado derivado de cirurgia será usado sem nenhum dano adicional aos pacientes além da própria cirurgia e o estudo não envolve nenhum objetivo de diagnóstico ou perfil genético das amostras coletadas.

Amostras OS, já existentes no BioBanca como amostras congeladas preservadas em nitrogênio líquido no BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), será usado para determinar os níveis iniciais de expressão de SENP1 em OS por RT-qPCR. Para isso, as amostras serão homogeneizadas, o RNA total será extraído e RT-qPCR será realizado dosando os níveis de expressão de SENP1.

As amostras restantes das 15, recém-colhidas, serão preservadas em solução fisiológica até o momento do uso. As amostras de OS serão cortadas em pedaços de 3 mm3, colocadas em uma placa de cultura de 24 poços múltiplos e cultivadas ex vivo como culturas organotípicas de OS em microambiente induzido por normóxia e hipóxia sob rotação orbital [21-23]. O tecido tumoral organotípico mantém a complexidade do tecido original com as células tumorais sendo cercadas por seu microambiente original em vez de matrizes artificiais e este sistema é particularmente vantajoso para triagem de drogas ex vivo, para estudar a absorção de drogas e processos moleculares. As culturas de OS serão tratadas com senpPNA-R8, e a expressão de SENP1 em amostras virgens e tratadas com PNA será determinada por RT-qPCR e imuno-histoquímica em seções embebidas em parafina. A capacidade do PNA-R8 de penetrar no núcleo hipóxico das amostras de OS será avaliada: após incubação com scrPNA-R8-Fl, os cortes serão imediatamente congelados (-80°C), processados ​​e analisados ​​por imunofluorescência.

As amostras serão analisadas e armazenadas no Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare no Istituto Ortopedico Galeazzi durante toda a duração do estudo. Ao final do estudo todo material residual será destruído.