Inhibice SENP1 pro potlačení růstu OS a metastáz

Pozadí:

Osteosarkom (OS) je nejčastějším typem primárního maligního kostního nádoru u dětí a dospívajících. Celková míra přežití je dramaticky snížena rozvojem metastáz, často plicních. Solidní maligní nádory, jako je OS, často vytvářejí hypoxické mikroprostředí, které přispívá k růstu nádoru, metastázám, selhání léčby a úmrtnosti pacientů. Adaptace na hypoxii, stejně jako na jiné podmínky prostředí, je často spojena s modifikacemi v post-transkripční regulaci klíčových efektorů. Mezi nimi je SUMOylace prováděna malými proteiny modifikátoru podobnými ubikvitinu (SUMO) a je dynamicky reverzována (deSUMOylace) proteázami specifickými pro Sentrin/SUMO (SENP). SENP1, nejlépe charakterizovaný SENP, je upregulován ve více nádorech, které se účastní tumorigeneze a progrese nádoru. Prostřednictvím deSUMOylace SENP1 působí jako molekulární hub, který stabilizuje a aktivuje klíčové regulační faktory, jako je hypoxií indukovatelný faktor 1α (HIF1α), homeobox 1 vázající E-box se zinkovým prstem (ZEB1) a Akt, zodpovědný za adaptaci nádorových buněk na hypoxické mikroprostředí, indukce buněčné proliferace, invaze a migrace a inhibice apoptózy, čímž přispívá k progresi nádoru a metastázování.

HIFla je hlavní transkripční regulátor pro buněčnou adaptaci a přežití za hypoxických podmínek a přispívá ke zvýšení buněčného metastatického potenciálu. DESUMOylace HIF1a zprostředkovaná SENP1 zabraňuje degradaci HIF1a proteazomem, čímž se aktivuje signální dráha HIF1a. SENP1 je nadměrně exprimován v buňkách OS za hypoxických podmínek a umlčení SENP1 zprostředkované siRNA snižuje životaschopnost nádorových buněk, podporuje buněčnou apoptózu, snižuje invazivitu a inhibuje epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT).

ZEB1 se účastní tumorigeneze, progrese, invaze a metastáz v několika tumorech (např. glioblastom, prostata, plíce, játra a kolorektální karcinom). Umlčení ZEB1 v buňkách OS vede ke snížené aktivitě kaspázy-3, inhibici NF-KB a iNOS, celkově snížené proliferaci buněk a zvýšené apoptóze. Knockdown SENP1 v buňkách hepatocelulárního karcinomu (HCC) snižuje ZEB1 a inhibuje EMT].

Hyperaktivace Akt je nezbytná pro vznik a progresi nádorů, včetně OS. V buňkách astrogliomu je inhibice SENP1 zprostředkovaná siRNA spojena s hypofosforylací Akt doprovázenou inhibicí jeho downstream cílů Bcl-xL a upregulace cyklinuD1 a p21, což vede k zastavení buněčného cyklu a zvýšené apoptóze.

Celkově tyto studie naznačují, že SENP1 působí jako centrum, jehož inhibice se odráží na více cílech, z nichž některé, tj. HIF1α, ZEB1, Akt, jsou klíčovými faktory progrese nádoru a metastáz jak u normoxie, tak u hypoxie. I když je znám účinek SENP1 na HIF1a v OS, je rozumné předpokládat, že SENP1 může zprostředkovat downregulaci ZEB1 a inaktivaci Akt také v OS. Nové strategie inhibice SENP1 jsou tedy potenciálně účinnými terapeutickými přístupy k blokování růstu OS a metastáz.

Inhibice SENP1 může být dosaženo umlčením genu zprostředkovaným siRNA. Nahé siRNA jsou však vysoce nestabilní a dodávací systémy na bázi lipozomů jsou málo účinné a cytotoxické jak in vitro, tak in vivo. Slibným přístupem k inhibici exprese SENP1 je umlčování genů zprostředkované peptidovými nukleovými kyselinami (PNA), oligomery nukleobází s fosfátovým skeletem nahrazeným pseudopeptidovým skeletem opakovaných jednotek N-(2-aminoethyl)glycinu. Vzhledem k jejich nepřirozené páteři jsou PNA definitivně rezistentní vůči aktivitám nukleázy i proteázy, tvoří specifičtější a stabilnější vazbu s komplementární DNA nebo RNA, což umožňuje účinný a trvalý umlčovací účinek. Ačkoli je permeabilita buněk PNA velmi špatná, lze ji účinně zvýšit jejich konjugací s peptidy pronikajícími do buněk (CPP). V posledních letech se PNA ukázaly jako skutečně slibné nástroje pro diagnostiku a terapii rakoviny a především jako efektivní kandidáti na stabilní umlčení genů v genové terapii.

Racionální a předběžná studie:

Budou navrženy a testovány 3 různé sekvence PNA zacílené na různé oblasti mRNA SENP1. PNA budou konjugovány s okta-argininem (R8) CPP, který účinně zprostředkovává intracelulární dodávání PNA. Absorpce bude studována s míchanou sekvencí R8- a fluoresceinem (Fl)-konjugovanou PNA (scrPNA-R8-Fl).

V buněčných liniích OS bude provedena in vitro charakterizace schopnosti navržené PNA-CPP pronikat intracelulárně a umlčet cílový SENP1.

Ke studiu vychytávání PNA-R8 v buňkách OS budou různé buněčné linie OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) s různým invazivním potenciálem a všechny exprimující SENP1 a primární lidské osteoblasty (hOb) jako negativní kontrola pro expresi SENP1. být použit. Po inkubaci se scrPNA-R8-Fl v různých koncentracích bude příjem stanoven v po sobě jdoucích časových bodech průtokovou cytometrií, zatímco cytoplazmatická lokalizace bude potvrzena fluorescenční mikroskopií. scrPNA-Fl nekonjugovaný s R8 bude fungovat jako negativní kontrola, protože se neočekává, že vstoupí do buňky. Cytotoxicita scrPNA-R8 bude testována pomocí testu Alamar Blue Cell Viability. Účinnost umlčování různých anti-SENP1 PNA-R8 konjugátů (senpPNA-R8) bude testována ve všech buněčných liniích jak v normoxii, tak v hypoxii (1 % O2, 5 % CO2 a 94 % N2). Účinnost umlčování SENP1 zprostředkovaná senpPNA-R8 bude hodnocena pomocí RT-qPCR a western-blotu (WB). scrPNA-R8 bude sloužit jako negativní kontrola, zatímco buňky transfekované siRNA cílící na SENP1 budou sloužit jako pozitivní kontrola. V této části bude vybrána nejúčinnější umlčující sloučenina senpPNA-R8.

SenpPNA-R8-zprostředkovaná downregulace HIFla a potenciálně exprese ZEB1 a inhibice fosforylace Akt, jako důsledek inhibice SENP1 v buňkách OS, bude testována WB. Bude tedy testována snížená životaschopnost buněk, migrace a invaze, indukce apoptózy a inhibice EMT a porovnány s účinky v hOb. Životaschopnost buněk bude stanovena testem Alamar Blue, zatímco apoptóza bude testována průtokovou cytometrií barvením Annexinem V a propidium jodidem. Zbytková migrace a schopnost invaze budou hodnoceny testem hojení ran a testem transwell invaze, v daném pořadí. Downregulace vimentinu a N-cadherinu a upregulace E-cadherinu, EMT markerů a downstream cílů ZEB1 (kaspáza-3, NF-κB) a Akt, (cyklinD1 a Bcl-xL) bude stanovena pomocí WB.

In vitro charakterizace schopnosti penetrace a umlčování navrženého PNA-CPP v buněčných liniích OS je předběžným krokem studie. Bude následovat ex vivo analýza schopnosti PNA-CPP proniknout do 3D tkáně a umlčet cílový SENP v explantátu tkáně OS od pacientů.

Cíle studie:

Cílem tohoto projektu je otestovat nový silný inhibitor SENP1 na bázi PNA, dříve charakterizovaný na in vitro modelu OS buněčných linií.

Nejúčinnější PNA konjugovaná s buněčně propustným CPP, který je schopen inhibovat životaschopnost a invazivitu OS buněk v normoxii i hypoxii prostřednictvím SENP1 zprostředkované inhibice HIF1α, ZEB1 a Akt, bude zkoumána z hlediska své schopnosti pronikat a umlčení exprese SENP1 v ex vivo lidských tkáních OS.

Primární cíl:

Stanovit schopnost PNA-CPP pronikat do ex vivo trojrozměrné tkáně OS, pocházející z plýtvaného biologického materiálu získaného během chirurgického zákroku na eradikaci OS, a uplatnit svou biologickou funkci inhibice SENP1 v tkáni.

Studovat design:

Pro tuto studii bude shromažďován odpadní biologický materiál pocházející z chirurgické eradikace osteosarkomu, který tvoří pouze malou část odstraněné nádorové hmoty jiné než té, která byla použita pro histologickou a molekulární diagnostiku.

Bude přijato 15 pacientů s primárním OS. Cílovou skupinou budou pacienti hospitalizovaní na IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, kteří budou podrobeni chirurgické eradikaci primární OS.

Studie bude prezentována pacientům ve věku ≥18 let, kteří mohou být náborováni také v protokolu IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (schválení etickou komisí č. 29/INT/2017) chirurgem. Tito pacienti podepíší dva informované souhlasy: jeden pro BioBanca a jeden pro studii PNA-OS.

Kromě IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca budou přijati pacienti ve věku <18 let. Tito pacienti budou považováni za způsobilé pro studii, pokud právní poradce podepíše informované souhlasy týkající se studie PNA-OS.

Také vzorky OS již existující v BioBanca jako zmrazené vzorky konzervované v kapalném dusíku u BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), bude používán. Bude vynaloženo veškeré přiměřené úsilí, aby se tyto pacienty vyzvaly, aby podepsali konkrétní informovaný souhlas související s touto studií.

Vzhledem k několika praktickým problémům (např. se může vyskytnout nevhodnost nebo malé množství biologického materiálu), předpokládáme možnost náboru dalších pacientů až do dosažení 15 kompletních vzorků.

Studie bude zahájena po schválení etickou komisí a předpokládaná doba trvání je 36 měsíců, rozdělená takto:

• Doba registrace: 24 měsíců
• Analýza dat: 12 měsíců

Experimentální design:

Ex vivo analýza schopnosti tlumení PNA-R8 ve vzorcích osteosarkomu. Budeme zkoumat, zda je senpPNA-R8 schopen proniknout do trojrozměrné tkáně OS a uplatnit svůj tišící účinek.

15 vzorků OS bude odebráno buď v rámci IRCCS Galeazzi BioBanca (schválení etické komise č. 29/INT/2017) nebo od nově přijatých pacientů ve spolupráci s C.C.O.O.R.R. vybavit.

Pouze odpadní biologický materiál pocházející z chirurgického zákroku bude použit bez jakéhokoli dalšího poškození pacientů kromě samotného chirurgického zákroku a studie nezahrnuje žádný diagnostický cíl nebo genetické profilování odebraných vzorků.

Vzorky OS, které již existují v BioBanca jako zmrazené vzorky konzervované v kapalném dusíku u poskytovatele služeb BioRep (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), bude použit ke stanovení počátečních hladin exprese SENP1 v OS pomocí RT-qPCR. Za tímto účelem budou vzorky homogenizovány, bude extrahována celková RNA a RT-qPCR bude proveden test na hladiny exprese SENP1.

Zbývající vzorky z 15, čerstvě odebrané, budou až do použití uchovány ve fyziologickém roztoku. Vzorky OS budou nakrájeny na 3 mm3 kousky, umístěny do 24jamkové kultivační plotny a kultivovány ex vivo jako organotypické kultury OS v mikroprostředí vyvolaném normoxií i hypoxií za orbitální rotace [21-23]. Organotypická nádorová tkáň si udržuje komplexnost původní tkáně s nádorovými buňkami obklopenými jejich původním mikroprostředím spíše než umělými matricemi a tento systém je zvláště výhodný pro ex vivo screening léků, pro studium příjmu léků a molekulárních procesů. Kultury OS budou ošetřeny senpPNA-R8 a exprese SENP1 v naivních vzorcích a vzorcích ošetřených PNA bude stanovena pomocí RT-qPCR a imunohistochemie v řezech zalitých v parafínu. Bude hodnocena schopnost PNA-R8 pronikat do hypoxického jádra vzorků OS: po inkubaci s scrPNA-R8-Fl budou řezy okamžitě zmraženy (-80 °C), zpracovány a analyzovány imunofluorescencí.

Vzorky budou analyzovány a skladovány v Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare v Istituto Ortopedico Galeazzi po celou dobu trvání studie. Na konci studie bude každý zbytkový materiál zničen.