Inhibición de SENP1 para la supresión del crecimiento y la metástasis del sistema operativo

Fondo:

El osteosarcoma (OS) es el tipo más común de tumor óseo maligno primario en niños y adolescentes. La tasa de supervivencia general se reduce drásticamente por el desarrollo de metástasis, a menudo pulmonares. Los tumores malignos sólidos, como el OS, a menudo desarrollan un microambiente hipóxico, lo que contribuye al crecimiento del tumor, la metástasis, el fracaso del tratamiento y la mortalidad del paciente. La adaptación a la hipoxia, así como a otras condiciones ambientales, a menudo se asocia con modificaciones en la regulación postranscripcional de efectores clave. Entre estos, la SUMOilación la llevan a cabo pequeñas proteínas modificadoras similares a la ubiquitina (SUMO) y se invierte dinámicamente (desSUMOilación) por las proteasas específicas de Sentrin/SUMO (SENP). SENP1, el SENP mejor caracterizado, está regulado positivamente en múltiples tumores y está involucrado en la tumorigénesis y la progresión tumoral. A través de la deSUMOilación, SENP1 actúa como un centro molecular que estabiliza y activa factores reguladores clave, como el factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α), la homeobox 1 de unión a la caja E con dedos de zinc (ZEB1) y Akt, responsable de la adaptación de las células tumorales a la hipoxia. microambiente, la inducción de la proliferación, invasión y migración celular, y la inhibición de la apoptosis, contribuyendo así a la progresión tumoral y la metástasis.

HIF1α es el principal regulador transcripcional para la adaptación y supervivencia celular en condiciones hipóxicas y contribuye a potenciar el potencial metastásico celular. La deSUMOilación de HIF1α mediada por SENP1 previene la degradación de HIF1α por el proteasoma, activando así la vía de señalización de HIF1α. SENP1 se sobreexpresa en células OS en condiciones hipóxicas y el silenciamiento de SENP1 mediado por ARNsi disminuye la viabilidad de las células tumorales, promueve la apoptosis celular, reduce la invasividad e inhibe la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT).

ZEB1 participa en la tumorigénesis, progresión, invasión y metástasis en varios tumores (p. glioblastoma, próstata, pulmón, hígado y colorrectal). El silenciamiento de ZEB1 en células OS conduce a una actividad de caspasa-3 reducida, inhibición de NF-κB e iNOS, proliferación celular reducida en general y aumento de la apoptosis. La eliminación de SENP1 en células de carcinoma hepatocelular (HCC) disminuye ZEB1 e inhibe EMT].

La hiperactivación de Akt es esencial para la aparición y progresión de los tumores, incluido el OS. En las células de astroglioma, la inhibición de SENP1 mediada por ARNip se asocia con la hipofosforilación de Akt acompañada de la inhibición de sus objetivos aguas abajo Bcl-xL y la regulación al alza de ciclinaD1 y p21, lo que lleva a la detención del ciclo celular y al aumento de la apoptosis.

En conjunto, estos estudios sugieren que SENP1 actúa como un centro cuya inhibición se refleja en múltiples objetivos, algunos de los cuales, p. HIF1α, ZEB1, Akt, son factores clave en la progresión tumoral y la metástasis tanto en normoxia como en hipoxia. Si bien se conoce el efecto de SENP1 en HIF1α en el sistema operativo, es razonable suponer que SENP1 podría mediar en la regulación negativa de ZEB1 y la inactivación de Akt también en el sistema operativo. Por lo tanto, las nuevas estrategias de inhibición de SENP1 son enfoques terapéuticos potencialmente efectivos para bloquear el crecimiento y la metástasis del sistema operativo.

La inhibición de SENP1 se puede lograr mediante el silenciamiento génico mediado por siRNA. Sin embargo, los siRNA desnudos son muy inestables y los sistemas de administración basados ​​en liposomas son poco eficaces y citotóxicos tanto in vitro como in vivo. Un enfoque prometedor para la inhibición de la expresión de SENP1 es el silenciamiento génico mediado por ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oligómeros de nucleobase con el esqueleto de fosfato reemplazado por un esqueleto de pseudopéptido de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)glicina. Debido a su estructura no natural, los PNA son definitivamente resistentes a las actividades de nucleasa y proteasa, forman una unión más específica y estable con el ADN o ARN complementario, lo que permite un efecto silenciador eficiente y persistente. Aunque la permeabilidad de las células de PNA es muy pobre, puede mejorarse de manera efectiva mediante su conjugación con péptidos de penetración celular (CPP). En los últimos años, los PNA se han convertido en herramientas realmente prometedoras para el diagnóstico y la terapia del cáncer y, sobre todo, como candidatos efectivos para el silenciamiento génico estable en terapia génica.

Estudio racional y preliminar:

Se diseñarán y probarán 3 secuencias de PNA diferentes dirigidas a diferentes regiones de ARNm de SENP1. Los PNA se conjugarán con un CPP de octa-arginina (R8) que media de manera eficaz en el suministro intracelular de PNA. La captación se estudiará con un PNA conjugado con fluoresceína (Fl) y R8 de secuencia codificada (scrPNA-R8-Fl).

Se realizará una caracterización in vitro de la capacidad del PNA-CPP diseñado para penetrar intracelularmente y silenciar el SENP1 diana en líneas celulares de OS.

Para estudiar la captación de PNA-R8 en células OS, diferentes líneas celulares OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) con diferente potencial invasivo y todas expresando SENP1, y osteoblastos humanos primarios (hOb) como control negativo para la expresión de SENP1, se ser usado. Después de la incubación con scrPNA-R8-Fl a diferentes concentraciones, la captación se determinará en puntos de tiempo consecutivos mediante citometría de flujo, mientras que la localización citoplasmática se confirmará mediante microscopía de fluorescencia. Un scrPNA-Fl no conjugado con R8 funcionará como un control negativo, ya que no se espera que entre en la célula. La citotoxicidad de scrPNA-R8 se analizará mediante el ensayo Alamar Blue Cell Viability. La eficacia silenciadora de los diferentes conjugados anti-SENP1 PNA-R8 (senpPNA-R8) se evaluará en todas las líneas celulares tanto en normoxia como en hipoxia (1% O2, 5% CO2 y 94% N2). La eficiencia de silenciamiento de SENP1 mediada por senpPNA-R8 se evaluará mediante RT-qPCR y western-blot (WB). scrPNA-R8 servirá como control negativo, mientras que las células transfectadas con siRNA dirigido a SENP1 servirán como control positivo. En esta parte se seleccionará el compuesto senpPNA-R8 más eficaz para silenciar.

WB analizará la regulación a la baja mediada por senpPNA-R8 de HIF1α, y potencialmente de la expresión de ZEB1 y las inhibiciones de la fosforilación de Akt, como consecuencia de la inhibición de SENP1 en células OS. Por lo tanto, se ensayarán la viabilidad celular reducida, la migración y la invasión, la inducción de la apoptosis y la inhibición de la EMT, y se compararán con los efectos en hOb. La viabilidad celular se determinará mediante el ensayo Alamar Blue, mientras que la apoptosis se evaluará mediante citometría de flujo mediante tinción de anexina V y con yoduro de propidio. La migración residual y la capacidad de invasión se evaluarán mediante un ensayo de cicatrización de heridas y un ensayo de invasión transwell, respectivamente. El WB determinará la regulación negativa de vimentina y N-cadherina y la regulación positiva de E-cadherina, marcadores EMT y de los objetivos aguas abajo de ZEB1 (caspasa-3, NF-κB) y Akt (ciclina D1 y Bcl-xL).

La caracterización in vitro de la capacidad de penetración y silenciamiento del PNA-CPP diseñado en líneas celulares OS es el paso preliminar del estudio. A continuación, se realizará un análisis ex vivo de la capacidad del PNA-CPP para penetrar en un tejido 3D y silenciar el SENP objetivo en un explante de tejido OS de los pacientes.

Objetivos del estudio:

El objetivo de este proyecto es probar un nuevo y potente inhibidor de SENP1 basado en PNA, previamente caracterizado en un modelo in vitro de líneas celulares OS.

El PNA más efectivo, conjugado con un CPP permeable a las células, que es capaz de inhibir la viabilidad y la invasividad de las células OS tanto en normoxia como en hipoxia a través de la inhibición de HIF1α, ZEB1 y Akt mediada por SENP1, será investigado por su capacidad para penetrar y silenciar la expresión de SENP1 en tejidos OS humanos ex vivo.

Objetivo principal:

Determinar la capacidad de PNA-CPP para penetrar en un tejido tridimensional ex vivo de OS, derivado de material biológico de desecho obtenido durante la cirugía de erradicación de OS, y ejercer su función biológica de inhibición de SENP1 dentro del tejido.

Diseño del estudio:

Para este estudio se recogerá material biológico de desecho derivado de la cirugía de erradicación del osteosarcoma que constituye sólo una pequeña proporción de la masa tumoral extirpada distinta de la utilizada para el diagnóstico histológico y molecular.

Se reclutarán 15 pacientes con SG primaria. El grupo objetivo estará compuesto por pacientes hospitalizados en el IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi que serán sometidos a la erradicación quirúrgica del OS primario.

El estudio será presentado a pacientes con edad ≥18 años que pueden ser reclutados también en el protocolo IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (aprobación del comité ético n. 29/INT/2017) por el cirujano. Estos pacientes firmarán dos Consentimientos Informados: uno para el BioBanca y otro para el estudio PNA-OS.

Además del IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca, se reclutarán pacientes con edad <18 años. Estos pacientes serán considerados elegibles para el estudio si el tutor legal firmará los Consentimientos Informados relativos al estudio PNA-OS.

También muestras de OS ya existentes en BioBanca como muestras congeladas conservadas en nitrógeno líquido en BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Se utilizará Via Olgettina 60, 20132, Milán). Se harán todos los esfuerzos razonables para llamar a estos pacientes a firmar un consentimiento informado específico relativo a este estudio.

Dado que varias cuestiones prácticas (p. inadecuación o baja cantidad de material biológico), se prevé la posibilidad de reclutar pacientes adicionales hasta lograr 15 muestras completas.

El Estudio comenzará después de la aprobación del Comité Ético y la duración estimada es de 36 meses, divididos de la siguiente manera:

• Tiempo de inscripción: 24 meses
• Análisis de datos: 12 meses

Diseño experimental:

Análisis ex vivo de la capacidad silenciadora de PNA-R8 en muestras de osteosarcoma. Investigaremos si senpPNA-R8 es capaz de penetrar en un tejido OS tridimensional y ejercer su efecto silenciador.

Se recolectarán 15 muestras de OS ya sea en el contexto del IRCCS Galeazzi BioBanca (aprobación del comité ético n. 29/INT/2017) o de pacientes recién reclutados, en colaboración con el C.C.O.O.R.R. equipar.

Únicamente se utilizará material biológico de desecho derivado de la cirugía sin perjuicio adicional para los pacientes más allá de la propia cirugía y el estudio no tiene ninguna finalidad diagnóstica ni perfilado genético de las muestras recogidas.

Muestras de OS, ya existentes en BioBanca como muestras congeladas conservadas en nitrógeno líquido en BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), se utilizará para determinar los niveles de expresión inicial de SENP1 en OS mediante RT-qPCR. Para ello, se homogeneizarán las muestras, se extraerá el ARN total y se realizará una RT-qPCR ensayando los niveles de expresión de SENP1.

Las muestras restantes de 15, recién recolectadas, se conservarán en solución fisiológica hasta su uso. Las muestras de OS se cortarán en piezas de 3 mm3, se colocarán en una placa de cultivo de 24 pocillos múltiples y se cultivarán ex vivo como cultivos de OS organotípicos en microambientes inducidos por normoxia e hipoxia bajo rotación orbital [21-23]. El tejido tumoral organotípico mantiene la complejidad del tejido original con células tumorales rodeadas por su microambiente original en lugar de matrices artificiales y este sistema es particularmente ventajoso para la detección de fármacos ex vivo, para estudiar la absorción de fármacos y los procesos moleculares. Los cultivos de OS se tratarán con senpPNA-R8, y la expresión de SENP1 en muestras vírgenes y tratadas con PNA se determinará mediante RT-qPCR e inmunohistoquímica en secciones incluidas en parafina. Se evaluará la capacidad del PNA-R8 para penetrar en el núcleo hipóxico de las muestras de SO: después de la incubación con scrPNA-R8-Fl, las secciones se congelarán inmediatamente (-80 °C), se procesarán y analizarán mediante inmunofluorescencia.

Las muestras se analizarán y almacenarán en el Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare en el Istituto Ortopedico Galeazzi durante toda la duración del estudio. Al final del estudio se destruirá todo material residual.