Remming van SENP1 voor de onderdrukking van OS-groei en metastase

Achtergrond:

Osteosarcoom (OS) is het meest voorkomende type primaire kwaadaardige bottumor bij kinderen en adolescenten. Het totale overlevingspercentage wordt dramatisch verminderd door de ontwikkeling van metastasen, vaak pulmonair. Solide kwaadaardige tumoren, zoals OS, ontwikkelen vaak een hypoxische micro-omgeving, die bijdraagt ​​aan tumorgroei, metastase, falen van de behandeling en patiëntsterfte. Aanpassing aan hypoxie, evenals aan andere omgevingsomstandigheden, wordt vaak geassocieerd met wijzigingen in de post-transcriptionele regulatie van belangrijke effectoren. Hiervan wordt SUMOylation uitgevoerd door kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMO) eiwitten en wordt dynamisch omgekeerd (deSUMOylation) door Sentrin / SUMO-specifieke proteasen (SENP's). SENP1, de best gekarakteriseerde SENP, wordt opgereguleerd in meerdere tumoren die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van tumoren en tumorprogressie. Door deSUMOylatie fungeert SENP1 als een moleculaire hub die belangrijke regulerende factoren stabiliseert en activeert, zoals hypoxie-induceerbare factor 1α (HIF1α), zinkvinger E-box binding homeobox 1 (ZEB1) en Akt, verantwoordelijk voor de aanpassing van tumorcellen aan hypoxische micro-omgeving, inductie van celproliferatie, invasie en migratie, en remming van apoptose, wat bijdraagt ​​aan tumorprogressie en metastase.

HIF1α is de belangrijkste transcriptionele regulator voor cellulaire aanpassing en overleving onder hypoxische omstandigheden, en draagt ​​bij aan het verbeteren van het metastatische potentieel van de cel. SENP1-gemedieerde HIF1α-deSUMOylatie voorkomt HIF1α-degradatie door proteasoom, waardoor de HIF1α-signaalroute wordt geactiveerd. SENP1 komt tot overexpressie in OS-cellen onder hypoxische toestand en siRNA-gemedieerde uitschakeling van SENP1 vermindert de levensvatbaarheid van tumorcellen, bevordert celapoptose, vermindert invasiviteit en remt de epitheel-mesenchymale overgang (EMT).

ZEB1 is betrokken bij tumorigenese, progressie, invasie en metastasen in verschillende tumoren (bijv. glioblastoom, prostaat, long, lever en colorectaal). ZEB1-uitschakeling in OS-cellen leidt tot een verminderde caspase-3-activiteit, NF-KB- en iNOS-remming, algehele verminderde celproliferatie en verhoogde apoptose. SENP1 knockdown in hepatocellulaire carcinoom (HCC) cellen verlaagt ZEB1 en remt EMT].

Akt-hyperactivering is essentieel voor het ontstaan ​​en de progressie van tumoren, inclusief OS. In astroglioomcellen is siRNA-gemedieerde remming van SENP1 geassocieerd met Akt-hypofosforylering, vergezeld van de remming van zijn stroomafwaartse doelen Bcl-xL en opregulatie van cyclinD1 en p21, wat leidt tot stopzetting van de celcyclus en verhoogde apoptose.

Al met al suggereren deze onderzoeken dat SENP1 fungeert als een hub waarvan de remming op meerdere doelen reflecteert, waarvan sommige, d.w.z. HIF1α, ZEB1, Akt zijn sleutelfactoren in tumorprogressie en metastase bij zowel normoxia als hypoxie. Hoewel het effect van SENP1 op HIF1α in OS bekend is, is het redelijk om aan te nemen dat SENP1 ZEB1-downregulatie en Akt-inactivatie ook in OS zou kunnen bemiddelen. Nieuwe SENP1-remmingsstrategieën zijn dus potentieel effectieve therapeutische benaderingen om OS-groei en metastase te blokkeren.

SENP1-remming kan worden bereikt door genuitschakeling gemedieerd door siRNA's. Naakte siRNA's zijn echter zeer onstabiel en op liposomen gebaseerde toedieningssystemen zijn slecht efficiënt en cytotoxisch, zowel in vitro als in vivo. Een veelbelovende benadering voor remming van SENP1-expressie is gen-uitschakeling gemedieerd door peptide-nucleïnezuren (PNA), nucleobase-oligomeren waarbij de fosfaatruggengraat is vervangen door een pseudopeptide-ruggengraat van herhaalde eenheden van N- (2-aminoethyl) glycine. Vanwege hun onnatuurlijke ruggengraat zijn PNA's definitief resistent tegen zowel nuclease- als proteaseactiviteiten, vormen ze een meer specifieke en stabiele binding met het complementaire DNA of RNA, waardoor een efficiënt en aanhoudend silencing-effect mogelijk is. Hoewel de permeabiliteit van PNA-cellen erg slecht is, kan deze effectief worden verbeterd door hun conjugatie met celpenetrerende peptiden (CPP). In de afgelopen jaren zijn PNA naar voren gekomen als veelbelovende hulpmiddelen voor de diagnose en therapie van kanker, en vooral als effectieve kandidaten voor het stabiel uitschakelen van genen in gentherapie.

Rationele en voorstudie:

Er zullen 3 verschillende PNA-sequenties worden ontworpen en getest die zich richten op verschillende SENP1-mRNA-regio's. PNA's zullen worden geconjugeerd met een octa-arginine (R8) CPP die op efficiënte wijze de intracellulaire afgifte van PNA's bemiddelt. De opname zal bestudeerd worden met een scrambled-sequence R8- en fluoresceïne (Fl)-geconjugeerde PNA (scrPNA-R8-Fl).

Een in vitro karakterisering van het vermogen van het ontworpen PNA-CPP om intracellulair te penetreren en het doelwit SENP1 tot zwijgen te brengen zal worden uitgevoerd in cellijnen van OS.

Om de opname van PNA-R8 in OS-cellen te bestuderen, zullen verschillende OS-cellijnen (SaOS-2, MG-63, U2OS) met verschillend invasief potentieel en die allemaal SENP1 tot expressie brengen, en primaire menselijke osteoblasten (hOb) als negatieve controle voor SENP1-expressie, worden gebruikt. Na incubatie met scrPNA-R8-Fl in verschillende concentraties zal de opname op opeenvolgende tijdstippen worden bepaald door middel van flowcytometrie, terwijl de cytoplasmatische lokalisatie zal worden bevestigd door middel van fluorescentiemicroscopie. Een scrPNA-Fl die niet is geconjugeerd met R8 zal functioneren als een negatieve controle, aangezien niet wordt verwacht dat het de cel binnengaat. Cytotoxiciteit van scrPNA-R8 zal worden getest met de Alamar Blue Cell Viability-assay. De silencing-effectiviteit van de verschillende anti-SENP1 PNA-R8-conjugaten (senpPNA-R8) zal worden getest in alle cellijnen in zowel normoxia als hypoxie (1% O2, 5% CO2 en 94% N2). De senpPNA-R8-gemedieerde SENP1-uitschakelingsefficiëntie zal worden beoordeeld met RT-qPCR en western-blot (WB). scrPNA-R8 zal dienen als negatieve controle, terwijl cellen getransfecteerd met siRNA gericht op SENP1 zullen dienen als positieve controle. In dit deel wordt de meest efficiënte geluiddempende senpPNA-R8-compound geselecteerd.

De senpPNA-R8-gemedieerde neerwaartse regulatie van HIF1α, en mogelijk van ZEB1-expressie en Akt-fosforyleringsremmingen, als gevolg van SENP1-remming in OS-cellen, zal worden getest door WB. Aldus zullen verminderde cellevensvatbaarheid, migratie en invasie, inductie van apoptose en EMT-remming worden getest en vergeleken met de effecten in hOb. De levensvatbaarheid van de cellen zal worden bepaald met de Alamar Blue-test, terwijl apoptose zal worden getest met flowcytometrie door kleuring van Annexine V en met propidiumjodide. Het residuele migratie- en invasievermogen zal worden beoordeeld door middel van respectievelijk een wondgenezingstest en een transwell-invasietest. Neerwaartse regulatie van vimentine en N-cadherine en opwaartse regulatie van E-cadherine, EMT-markers en van de stroomafwaartse doelen van ZEB1 (caspase-3, NF-KB) en Akt, (cyclinD1 en Bcl-xL) zullen worden bepaald door WB.

De in vitro karakterisering van het penetratie- en silencing-vermogen van het ontworpen PNA-CPP in OS-cellijnen is de voorbereidende stap van het onderzoek. Een ex vivo analyse van het vermogen van de PNA-CPP om in een 3D-weefsel te penetreren en de beoogde SENP in een OS-weefselexplantaat van patiënten uit te schakelen, zal volgen.

Doelen van de studie:

Het doel van dit project is het testen van een nieuwe krachtige PNA-gebaseerde SENP1-remmer, eerder gekarakteriseerd in een in vitro model van OS-cellijnen.

De meest effectieve PNA, geconjugeerd met een celdoorlatende CPP, die de levensvatbaarheid en invasiviteit van OS-cellen in zowel normoxia als hypoxie kan remmen door SENP1-gemedieerde remming van HIF1α, ZEB1 en Akt, zal worden onderzocht op zijn vermogen om te penetreren en stilte SENP1-expressie in ex vivo menselijke OS-weefsels.

Hoofddoel:

Om het vermogen van PNA-CPP te bepalen om te penetreren in een ex vivo driedimensionaal weefsel van OS, afgeleid van verspild biologisch materiaal dat is verkregen tijdens OS-uitroeiingschirurgie, en om zijn biologische functie van remming van SENP1 in het weefsel uit te oefenen.

Studie opzet:

Voor deze studie zal verspild biologisch materiaal afkomstig van chirurgie voor de uitroeiing van osteosarcoom worden verzameld dat slechts een klein deel uitmaakt van de verwijderde tumormassa anders dan die gebruikt voor histologische en moleculaire diagnose.

Er zullen 15 patiënten met primaire OS worden aangeworven. De doelgroep bestaat uit patiënten die zijn opgenomen in het IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi en die zullen worden onderworpen aan chirurgische uitroeiing van primaire OS.

De studie zal worden gepresenteerd aan patiënten met een leeftijd ≥18 jaar die ook kunnen worden gerekruteerd in het IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca-protocol (goedkeuring van de ethische commissie nr. 29/INT/2017) door de chirurg. Deze patiënten zullen twee geïnformeerde toestemmingen ondertekenen: één voor de BioBanca- en één voor de PNA-OS-studie.

Naast het IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca zullen ook patiënten met een leeftijd <18 jaar worden geworven. Deze patiënten komen in aanmerking voor het onderzoek als de juridische begeleider de geïnformeerde toestemming met betrekking tot het PNA-OS-onderzoek ondertekent.

Ook monsters van OS die al in de BioBanca bestaan ​​als bevroren monsters bewaard in vloeibare stikstof bij BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), zal worden gebruikt. Elke redelijke inspanning zal worden gedaan om deze patiënten op te roepen om een ​​specifieke geïnformeerde toestemming met betrekking tot dit onderzoek te ondertekenen.

Aangezien verschillende praktische problemen (bijv. ongeschiktheid of lage hoeveelheid biologisch materiaal) kan optreden, voorzien we de mogelijkheid om extra patiënten te rekruteren tot het bereiken van 15 volledige monsters.

De studie zal starten na goedkeuring van de ethische commissie en de geschatte duur is 36 maanden, verdeeld als volgt:

• Timing voor inschrijving: 24 maanden
• Gegevensanalyse: 12 maanden

Experimenteel ontwerp:

Ex vivo analyse van het PNA-R8-uitschakelingsvermogen in osteosarcoommonsters. We zullen onderzoeken of senpPNA-R8 in staat is om door te dringen in een driedimensionaal OS-weefsel en zijn silencing-effect uit te oefenen.

Er zullen 15 OS-monsters worden verzameld in het kader van de IRCCS Galeazzi BioBanca (goedkeuring van de ethische commissie nr. 29/INT/2017) of van nieuw aangeworven patiënten, in samenwerking met de C.C.O.O.R.R. uitrusten.

Alleen verspild biologisch materiaal afkomstig van een operatie zal worden gebruikt zonder extra schade voor de patiënten, behalve de operatie zelf, en het onderzoek omvat geen diagnostisch doel of genetische profilering van de verzamelde monsters.

OS-monsters, al aanwezig in de BioBanca als bevroren monsters bewaard in vloeibare stikstof bij BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), zal worden gebruikt om de initiële expressieniveaus van SENP1 in OS te bepalen door RT-qPCR. Hiervoor zullen monsters worden gehomogeniseerd, zal totaal RNA worden geëxtraheerd en zal RT-qPCR worden uitgevoerd om te testen op SENP1-expressieniveaus.

De overige van de 15 monsters, vers verzameld, worden tot gebruik in fysiologische oplossing bewaard. De OS-monsters worden in stukjes van 3 mm3 gesneden, in een kweekplaat met 24 putjes geplaatst en ex vivo gekweekt als organotypische OS-culturen in zowel door normoxia als door hypoxie geïnduceerde micro-omgevingen onder orbitale rotatie [21-23]. Organotypisch tumorweefsel behoudt de complexiteit van het oorspronkelijke weefsel, waarbij tumorcellen worden omringd door hun oorspronkelijke micro-omgeving in plaats van kunstmatige matrices. OS-culturen zullen worden behandeld met senpPNA-R8, en SENP1-expressie in naïeve en met PNA behandelde monsters zal worden bepaald met RT-qPCR en immunohistochemie in paraffine-ingebedde secties. Het vermogen van de PNA-R8 om door te dringen in de hypoxische kern van de OS-monsters zal worden beoordeeld: na incubatie met scrPNA-R8-Fl worden secties onmiddellijk ingevroren (-80°C), verwerkt en geanalyseerd door middel van immunofluorescentie.

Monsters zullen worden geanalyseerd en opgeslagen in Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare in het Istituto Ortopedico Galeazzi voor de gehele duur van het onderzoek. Aan het einde van het onderzoek wordt al het restmateriaal vernietigd.