Inibizione di SENP1 per la soppressione della crescita e delle metastasi del sistema operativo

Sfondo:

L'osteosarcoma (OS) è il tipo più comune di tumore osseo maligno primitivo nei bambini e negli adolescenti. Il tasso di sopravvivenza globale è drasticamente ridotto dallo sviluppo di metastasi, spesso polmonari. I tumori maligni solidi, come l'OS, spesso sviluppano un microambiente ipossico, che contribuisce alla crescita del tumore, alla metastasi, al fallimento del trattamento e alla mortalità del paziente. L'adattamento all'ipossia, così come ad altre condizioni ambientali, è spesso associato a modifiche nella regolazione post-trascrizionale degli effettori chiave. Tra questi, la SUMOilazione è effettuata da piccole proteine ​​modificatrici simili all'ubiquitina (SUMO) ed è invertita dinamicamente (deSUMOilazione) dalle proteasi specifiche di Sentrin/SUMO (SENP). SENP1, il SENP meglio caratterizzato, è sovraregolato in più tumori essendo coinvolto nella tumorigenesi e nella progressione del tumore. Attraverso la deSUMOilazione, SENP1 agisce come un hub molecolare che stabilizza e attiva fattori regolatori chiave, come il fattore 1α inducibile dall'ipossia (HIF1α), l'omeobox 1 legante E-box del dito di zinco (ZEB1) e Akt, responsabile dell'adattamento delle cellule tumorali all'ipossico microambiente, induzione della proliferazione cellulare, invasione e migrazione e inibizione dell'apoptosi, contribuendo così alla progressione del tumore e alla metastasi.

HIF1α è il principale regolatore trascrizionale per l'adattamento cellulare e la sopravvivenza in condizioni ipossiche e contribuisce a migliorare il potenziale metastatico cellulare. La deSUMOilazione di HIF1α mediata da SENP1 previene la degradazione di HIF1α da parte del proteasoma, attivando così la via di segnalazione di HIF1α. SENP1 è sovraespresso nelle cellule OS in condizioni ipossiche e il silenziamento mediato da siRNA di SENP1 riduce la vitalità delle cellule tumorali, promuove l'apoptosi cellulare, riduce l'invasività e inibisce la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT).

ZEB1 è coinvolto nella tumorigenesi, progressione, invasione e metastasi in diversi tumori (ad es. glioblastoma, prostata, polmone, fegato e colorettale). Il silenziamento di ZEB1 nelle cellule OS porta a una ridotta attività della caspasi-3, inibizione di NF-κB e iNOS, proliferazione cellulare ridotta e aumento dell'apoptosi. Il knockdown di SENP1 nelle cellule di carcinoma epatocellulare (HCC) riduce ZEB1 e inibisce l'EMT].

L'iperattivazione di Akt è essenziale per l'insorgenza e la progressione dei tumori, inclusa la OS. Nelle cellule di astroglioma l'inibizione mediata da siRNA di SENP1 è associata all'ipofosforilazione di Akt accompagnata dall'inibizione dei suoi bersagli a valle Bcl-xL e dalla sovraregolazione della ciclina D1 e p21, che porta all'arresto del ciclo cellulare e all'aumento dell'apoptosi.

Complessivamente, questi studi suggeriscono che SENP1 agisce come un hub la cui inibizione si riflette su più bersagli, alcuni dei quali, ad es. HIF1α, ZEB1, Akt, sono fattori chiave nella progressione del tumore e nella metastasi sia nella normossia che nell'ipossia. Sebbene sia noto l'effetto di SENP1 su HIF1α in OS, è ragionevole presumere che SENP1 possa mediare la downregulation di ZEB1 e l'inattivazione di Akt anche in OS. Pertanto, le nuove strategie di inibizione di SENP1 sono approcci terapeutici potenzialmente efficaci per bloccare la crescita e le metastasi dell'OS.

L'inibizione di SENP1 può essere ottenuta mediante silenziamento genico mediato da siRNA. Tuttavia, i siRNA nudi sono altamente instabili e i sistemi di rilascio basati su liposomi sono scarsamente efficienti e citotossici sia in vitro che in vivo. Un approccio promettente per l'inibizione dell'espressione di SENP1 è il silenziamento genico mediato da acidi nucleici peptidici (PNA), oligomeri di nucleobasi con la spina dorsale del fosfato sostituita da una spina dorsale pseudopeptidica di unità ripetute di N-(2-amminoetil) glicina. A causa della loro spina dorsale innaturale, i PNA sono definitivamente resistenti sia alle attività nucleasiche che proteasiche, formano un legame più specifico e stabile con il DNA o RNA complementare, consentendo un effetto di silenziamento efficiente e persistente. Sebbene la permeabilità delle cellule PNA sia molto scarsa, può essere efficacemente migliorata dalla loro coniugazione con peptidi penetranti nelle cellule (CPP). Negli ultimi anni, i PNA sono emersi come strumenti molto promettenti per la diagnosi e la terapia del cancro e, soprattutto, come candidati efficaci per il silenziamento genico stabile nella terapia genica.

Studio razionale e preliminare:

Saranno progettate e testate 3 diverse sequenze di PNA mirate a diverse regioni dell'mRNA di SENP1. I PNA saranno coniugati ad un CPP di otta-arginina (R8) che media efficacemente il rilascio intracellulare di PNA. L'uptake sarà studiato con un PNA coniugato con R8 e fluoresceina (Fl) a sequenza codificata (scrPNA-R8-Fl).

Una caratterizzazione in vitro della capacità del PNA-CPP progettato di penetrare intracellulare e di silenziare il bersaglio SENP1 sarà effettuata in linee cellulari di OS.

Per studiare l'assorbimento di PNA-R8 nelle cellule OS, diverse linee cellulari OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) con diverso potenziale invasivo e tutte esprimenti SENP1 e osteoblasti umani primari (hOb) come controllo negativo per l'espressione di SENP1, saranno essere usato. Dopo l'incubazione con scrPNA-R8-Fl a diverse concentrazioni, l'uptake sarà determinato a tempi consecutivi mediante citometria a flusso, mentre la localizzazione citoplasmatica sarà confermata mediante microscopia a fluorescenza. Uno scrPNA-Fl non coniugato a R8 funzionerà come controllo negativo, poiché non è previsto che entri nella cellula. La citotossicità di scrPNA-R8 sarà valutata mediante l'Alamar Blue Cell Viability assay. L'efficacia di silenziamento dei diversi coniugati anti-SENP1 PNA-R8 (senpPNA-R8) sarà valutata in tutte le linee cellulari sia in normossia che in ipossia (1% O2, 5% CO2 e 94% N2). L'efficienza di silenziamento di SENP1 mediata da senpPNA-R8 sarà valutata mediante RT-qPCR e western-blot (WB). scrPNA-R8 fungerà da controllo negativo, mentre le cellule trasfettate con siRNA mirato a SENP1 fungeranno da controllo positivo. In questa parte verrà selezionato il composto senpPNA-R8 di silenziamento più efficiente.

La downregulation mediata da senpPNA-R8 di HIF1α, e potenzialmente delle inibizioni dell'espressione di ZEB1 e della fosforilazione di Akt, come conseguenza dell'inibizione di SENP1 nelle cellule OS, sarà valutata mediante WB. Pertanto, la ridotta vitalità cellulare, la migrazione e l'invasione, l'induzione dell'apoptosi e l'inibizione dell'EMT saranno analizzate e confrontate con gli effetti in hOb. La vitalità cellulare sarà determinata mediante saggio Alamar Blue, mentre l'apoptosi sarà valutata mediante citometria a flusso mediante colorazione con annessina V e con ioduro di propidio. La migrazione residua e la capacità di invasione saranno valutate rispettivamente mediante saggio di guarigione della ferita e saggio di invasione transwell. La downregulation di vimentina e N-caderina e la upregulation di E-caderina, marcatori EMT e dei target a valle di ZEB1 (caspase-3, NF-κB) e Akt, (cyclinD1 e Bcl-xL) saranno determinate da WB.

La caratterizzazione in vitro della capacità di penetrazione e silenziamento del PNA-CPP progettato nelle linee cellulari di OS è la fase preliminare dello studio. Seguirà un'analisi ex vivo della capacità del PNA-CPP di penetrare in un tessuto 3D e silenziare il SENP bersaglio in un espianto di tessuto OS da pazienti.

Obiettivi dello studio:

Lo scopo di questo progetto è testare un nuovo potente inibitore SENP1 basato su PNA, precedentemente caratterizzato in un modello in vitro di linee cellulari OS.

Il PNA più efficace, coniugato con un CPP permeabile alle cellule, che è in grado di inibire la vitalità e l'invasività delle cellule OS sia nella normossia che nell'ipossia attraverso l'inibizione mediata da SENP1 di HIF1α, ZEB1 e Akt, sarà studiato per la sua capacità di penetrare e silenziare l'espressione di SENP1 nei tessuti OS umani ex vivo.

Scopo primario:

Determinare la capacità di PNA-CPP di penetrare in un tessuto tridimensionale ex vivo di OS, derivato da materiale biologico di scarto ottenuto durante l'intervento chirurgico di eradicazione di OS, e di esercitare la sua funzione biologica di inibizione di SENP1 all'interno del tessuto.

Disegno dello studio:

Per questo studio, verrà raccolto materiale biologico di scarto derivato dalla chirurgia di eradicazione dell'osteosarcoma che comprende solo una piccola parte della massa tumorale rimossa diversa da quella utilizzata per la diagnosi istologica e molecolare.

Verranno reclutati 15 pazienti con OS primaria. Il target group comprenderà i pazienti ricoverati presso l'IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi che saranno sottoposti ad eradicazione chirurgica della OS primaria.

Lo studio sarà presentato a pazienti con età ≥18 anni che potranno essere reclutati anche nel protocollo IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (approvazione comitato etico n. 29/INT/2017) da parte del chirurgo. Questi pazienti firmeranno due Consensi Informati: uno per lo studio BioBanca e uno per lo studio PNA-OS.

Oltre all'IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca, verranno reclutati anche pazienti di età <18 anni. Questi pazienti saranno considerati eleggibili allo studio se il tutore legale firmerà i Consensi Informati relativi allo studio PNA-OS.

Anche campioni di OS già esistenti in BioBanca come campioni congelati conservati in azoto liquido presso BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano). Sarà fatto ogni ragionevole sforzo per chiamare questi pazienti a firmare uno specifico consenso informato relativo a questo studio.

Poiché diversi problemi pratici (ad es. inidoneità o scarsa quantità di materiale biologico), si prevede la possibilità di reclutare ulteriori pazienti fino al raggiungimento di 15 campioni completi.

Lo Studio inizierà dopo l'approvazione del Comitato Etico e la durata stimata è di 36 mesi, così suddivisi:

• Tempistica per l'iscrizione: 24 mesi
• Analisi dei dati: 12 mesi

Design sperimentale:

Analisi ex vivo della capacità di silenziamento del PNA-R8 nei campioni di osteosarcoma. Indagheremo se senpPNA-R8 è in grado di penetrare in un tessuto OS tridimensionale e di esercitare il suo effetto silenziante.

15 campioni di OS saranno raccolti nell'ambito dell'IRCCS Galeazzi BioBanca (approvazione comitato etico n. 29/INT/2017) o da pazienti di nuova assunzione, in collaborazione con il C.C.O.O.R.R. equipaggiare.

Verrà utilizzato solo materiale biologico di scarto derivato dalla chirurgia senza alcun danno aggiuntivo per i pazienti oltre alla chirurgia stessa e lo studio non comporta alcuno scopo diagnostico o profilazione genetica dei campioni raccolti.

Campioni OS, già esistenti in BioBanca come campioni congelati conservati in azoto liquido presso BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), saranno utilizzati per determinare i livelli iniziali di espressione di SENP1 in OS mediante RT-qPCR. Per questo, i campioni saranno omogeneizzati, l'RNA totale sarà estratto e sarà eseguita la RT-qPCR per determinare i livelli di espressione di SENP1.

I restanti campioni su 15, appena raccolti, verranno conservati in soluzione fisiologica fino al momento dell'utilizzo. I campioni di OS saranno tagliati in pezzi di 3 mm3, posti in una piastra di coltura a 24 pozzetti e coltivati ​​ex vivo come colture organotipiche di OS sia in microambiente indotto da normossia che da ipossia sotto rotazione orbitale [21-23]. Il tessuto tumorale organotipico mantiene la complessità del tessuto originale con le cellule tumorali circondate dal loro microambiente originale piuttosto che da matrici artificiali e questo sistema è particolarmente vantaggioso per lo screening farmacologico ex vivo, per lo studio dell'assorbimento del farmaco e dei processi molecolari. Le colture OS saranno trattate con senpPNA-R8, e l'espressione di SENP1 in campioni naïve e trattati con PNA sarà determinata mediante RT-qPCR e immunoistochimica in sezioni incluse in paraffina. Verrà valutata la capacità del PNA-R8 di penetrare all'interno del nucleo ipossico dei campioni OS: dopo l'incubazione con scrPNA-R8-Fl, le sezioni saranno immediatamente congelate (-80°C), processate e analizzate mediante immunofluorescenza.

I campioni saranno analizzati e conservati presso il Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare dell'Istituto Ortopedico Galeazzi per tutta la durata dello studio. Al termine dello studio ogni materiale residuo verrà distrutto.