Hemmung von SENP1 zur Unterdrückung von OS-Wachstum und Metastasierung

Hintergrund:

Das Osteosarkom (OS) ist der häufigste primäre bösartige Knochentumor bei Kindern und Jugendlichen. Die Gesamtüberlebensrate wird durch die Entwicklung von Metastasen, oft pulmonal, dramatisch reduziert. Solide bösartige Tumore wie OS entwickeln oft eine hypoxische Mikroumgebung, die zu Tumorwachstum, Metastasierung, Behandlungsversagen und Patientensterblichkeit beiträgt. Die Anpassung an Hypoxie sowie an andere Umweltbedingungen ist oft mit Modifikationen in der posttranskriptionellen Regulation von Schlüsseleffektoren verbunden. Unter diesen wird die SUMOylierung durch kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikatorproteine ​​(SUMO) durchgeführt und durch Sentrin/SUMO-spezifische Proteasen (SENPs) dynamisch umgekehrt (deSUMOylierung). SENP1, das am besten charakterisierte SENP, wird in mehreren Tumoren hochreguliert, die an der Tumorentstehung und Tumorprogression beteiligt sind. Durch die DeSUMOylierung fungiert SENP1 als molekularer Knotenpunkt, der wichtige regulatorische Faktoren stabilisiert und aktiviert, wie z. B. den Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF1α), die Zinkfinger-E-Box-bindende Homöobox 1 (ZEB1) und Akt, das für die Anpassung der Tumorzellen an die Hypoxie verantwortlich ist Mikroumgebung, Induktion von Zellproliferation, -invasion und -migration und Hemmung von Apoptose, wodurch sie zur Tumorprogression und Metastasierung beitragen.

HIF1α ist der Hauptregulator der Transkription für die zelluläre Anpassung und das Überleben unter hypoxischen Bedingungen und trägt dazu bei, das Metastasierungspotential der Zelle zu erhöhen. Die SENP1-vermittelte HIF1α-DeSUMOylierung verhindert den Abbau von HIF1α durch das Proteasom und aktiviert so den HIF1α-Signalweg. SENP1 wird in OS-Zellen unter hypoxischen Bedingungen überexprimiert, und die siRNA-vermittelte Stummschaltung von SENP1 verringert die Lebensfähigkeit der Tumorzellen, fördert die Zellapoptose, reduziert die Invasivität und hemmt den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT).

ZEB1 ist an der Tumorentstehung, -progression, -invasion und -metastasierung in mehreren Tumoren beteiligt (z. Glioblastom, Prostata, Lunge, Leber und Darm). ZEB1-Silencing in OS-Zellen führt zu einer reduzierten Caspase-3-Aktivität, NF-κB- und iNOS-Hemmung, insgesamt reduzierter Zellproliferation und erhöhter Apoptose. Der SENP1-Knockdown in hepatozellulären Karzinomzellen (HCC) verringert ZEB1 und hemmt EMT].

Akt-Hyperaktivierung ist essentiell für das Auftreten und Fortschreiten von Tumoren, einschließlich OS. In Astrogliomzellen ist die siRNA-vermittelte Hemmung von SENP1 mit einer Akt-Hypophosphorylierung verbunden, begleitet von der Hemmung seiner nachgeschalteten Ziele Bcl-xL und einer Hochregulation von CyclinD1 und p21, was zu einem Stillstand des Zellzyklus und einer erhöhten Apoptose führt.

Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass SENP1 als Knotenpunkt fungiert, dessen Hemmung sich auf mehrere Ziele auswirkt, von denen einige, d.h. HIF1α, ZEB1, Akt sind Schlüsselfaktoren für die Tumorprogression und Metastasierung sowohl bei Normoxie als auch bei Hypoxie. Während die Wirkung von SENP1 auf HIF1α bei OS bekannt ist, ist anzunehmen, dass SENP1 auch bei OS die ZEB1-Herunterregulierung und Akt-Inaktivierung vermitteln könnte. Daher sind neue SENP1-Inhibitionsstrategien potenziell wirksame therapeutische Ansätze, um OS-Wachstum und Metastasierung zu blockieren.

Die SENP1-Hemmung kann durch Gen-Silencing erreicht werden, das durch siRNAs vermittelt wird. Allerdings sind nackte siRNAs sehr instabil und Liposomen-basierte Abgabesysteme sind sowohl in vitro als auch in vivo wenig effizient und zytotoxisch. Ein vielversprechender Ansatz zur Hemmung der SENP1-Expression ist Gen-Silencing, vermittelt durch Peptid-Nukleinsäuren (PNA), Nukleobasen-Oligomere, bei denen das Phosphat-Rückgrat durch ein Pseudopeptid-Rückgrat aus sich wiederholenden Einheiten von N-(2-Aminoethyl)glycin ersetzt ist. Aufgrund ihres unnatürlichen Rückgrats sind PNAs sowohl gegenüber Nuklease- als auch Proteaseaktivitäten definitiv resistent, bilden eine spezifischere und stabilere Bindung mit der komplementären DNA oder RNA, was einen effizienten und anhaltenden Silencing-Effekt ermöglicht. Obwohl die PNA-Zellpermeabilität sehr schlecht ist, kann sie durch ihre Konjugation mit zelldurchdringenden Peptiden (CPP) effektiv verbessert werden. In den letzten Jahren haben sich PNA als wirklich vielversprechende Werkzeuge für die Krebsdiagnose und -therapie und vor allem als wirksame Kandidaten für stabiles Gen-Silencing in der Gentherapie herausgestellt.

Rationale und Vorstudie:

3 verschiedene PNA-Sequenzen, die auf verschiedene SENP1-mRNA-Regionen abzielen, werden entworfen und getestet. PNAs werden an ein Octa-Arginin (R8)-CPP konjugiert, das die intrazelluläre Abgabe von PNAs effizient vermittelt. Die Aufnahme wird mit einer scrambled-sequence R8- und Fluorescein (Fl)-konjugierten PNA (scrPNA-R8-Fl) untersucht.

Eine In-vitro-Charakterisierung der Fähigkeit des entworfenen PNA-CPP, intrazellulär zu penetrieren und das Ziel-SENP1 abzuschalten, wird in OS-Zelllinien durchgeführt.

Um die Aufnahme von PNA-R8 in OS-Zellen zu untersuchen, werden verschiedene OS-Zelllinien (SaOS-2, MG-63, U2OS) mit unterschiedlichem invasivem Potenzial und alle SENP1 exprimierend, sowie primäre humane Osteoblasten (hOb) als Negativkontrolle für die SENP1-Expression eingesetzt verwendet werden. Nach der Inkubation mit scrPNA-R8-Fl in verschiedenen Konzentrationen wird die Aufnahme zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten durch Durchflusszytometrie bestimmt, während die zytoplasmatische Lokalisierung durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wird. Ein scrPNA-F1, das nicht an R8 konjugiert ist, fungiert als Negativkontrolle, da nicht erwartet wird, dass es in die Zelle eindringt. Die Zytotoxizität von scrPNA-R8 wird mit dem Alamar Blue Cell Viability Assay untersucht. Die Stummschaltungswirksamkeit der verschiedenen Anti-SENP1-PNA-R8-Konjugate (senpPNA-R8) wird in allen Zelllinien sowohl bei Normoxie als auch bei Hypoxie (1 % O2, 5 % CO2 und 94 % N2) getestet. Die senpPNA-R8-vermittelte SENP1-Stummschaltungseffizienz wird durch RT-qPCR und Western-Blot (WB) bewertet. scrPNA-R8 dient als negative Kontrolle, während mit siRNA transfizierte Zellen, die auf SENP1 abzielen, als positive Kontrolle dienen. In diesem Teil wird die effizienteste Silencing-senpPNA-R8-Verbindung ausgewählt.

Die senpPNA-R8-vermittelte Herunterregulierung von HIF1α und möglicherweise der Hemmung der ZEB1-Expression und der Akt-Phosphorylierung als Folge der SENP1-Hemmung in OS-Zellen wird von WB untersucht. Daher werden reduzierte Zelllebensfähigkeit, Migration und Invasion, Induktion von Apoptose und EMT-Hemmung untersucht und mit den Wirkungen bei hOb verglichen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch den Alamar Blue-Assay bestimmt, während die Apoptose durch Durchflusszytometrie durch Färbung von Annexin V und mit Propidiumiodid untersucht wird. Die restliche Migrations- und Invasionsfähigkeit wird durch einen Wundheilungsassay bzw. einen Transwell-Invasionsassay bewertet. Die Herunterregulierung von Vimentin und N-Cadherin und die Hochregulierung von E-Cadherin, EMT-Markern und der nachgeschalteten Ziele von ZEB1 (Caspase-3, NF-κB) und Akt (CyclinD1 und Bcl-xL) werden von WB bestimmt.

Die In-vitro-Charakterisierung der Penetrations- und Silencing-Fähigkeit des entworfenen PNA-CPP in OS-Zelllinien ist der vorbereitende Schritt der Studie. Es folgt eine Ex-vivo-Analyse der Fähigkeit des PNA-CPP, in ein 3D-Gewebe einzudringen und das Ziel-SENP in einem OS-Gewebeexplantat von Patienten zum Schweigen zu bringen.

Ziele der Studie:

Das Ziel dieses Projekts ist es, einen neuen leistungsstarken PNA-basierten SENP1-Inhibitor zu testen, der zuvor in einem In-vitro-Modell von OS-Zelllinien charakterisiert wurde.

Die effektivste PNA, konjugiert mit einem zelldurchlässigen CPP, das in der Lage ist, die Lebensfähigkeit und Invasivität von OS-Zellen sowohl bei Normoxie als auch bei Hypoxie durch SENP1-vermittelte Hemmung von HIF1α, ZEB1 und Akt zu hemmen, wird auf seine Penetrationsfähigkeit untersucht und SENP1-Expression in ex vivo menschlichen OS-Geweben zum Schweigen zu bringen.

Hauptziel:

Um die Fähigkeit von PNA-CPP zu bestimmen, in ein dreidimensionales Ex-vivo-Gewebe von OS einzudringen, das aus verschwendetem biologischem Material stammt, das während einer OS-Eradikationsoperation erhalten wurde, und seine biologische Funktion der Hemmung von SENP1 innerhalb des Gewebes auszuüben.

Studiendesign:

Für diese Studie wird biologisches Abfallmaterial aus Osteosarkom-Eradikationsoperationen gesammelt, das nur einen kleinen Anteil der entfernten Tumormasse ausmacht, abgesehen von dem, das für die histologische und molekulare Diagnose verwendet wird.

15 Patienten mit primärem OS werden rekrutiert. Die Zielgruppe umfasst Patienten, die im IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi stationär behandelt werden und einer chirurgischen Eradikation des primären OS unterzogen werden.

Die Studie wird Patienten mit einem Alter von ≥ 18 Jahren vorgelegt, die vom Chirurgen auch im IRCCS-Protokoll des Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (Ethikausschuss-Genehmigung Nr. 29/INT/2017) rekrutiert werden können. Diese Patienten werden zwei Einverständniserklärungen unterzeichnen: eine für die BioBanca- und eine für die PNA-OS-Studie.

Neben dem IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca werden zusätzlich Patienten unter 18 Jahren rekrutiert. Diese Patienten gelten als für die Studie geeignet, wenn der gesetzliche Betreuer die Einverständniserklärung bezüglich der PNA-OS-Studie unterzeichnet.

Auch bereits in der BioBanca vorhandene Proben von OS als gefrorene Proben, die in flüssigem Stickstoff beim BioRep-Dienstleister (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132 Mailand), verwendet werden. Es werden alle angemessenen Anstrengungen unternommen, um diese Patienten aufzufordern, eine spezifische Einverständniserklärung in Bezug auf diese Studie zu unterzeichnen.

Da mehrere praktische Probleme (z. Ungeeignetheit oder geringe Menge an biologischem Material) auftreten können, sehen wir die Möglichkeit vor, weitere Patienten bis zum Erreichen von 15 vollständigen Proben zu rekrutieren.

Die Studie beginnt nach Genehmigung durch die Ethikkommission und die geschätzte Dauer beträgt 36 Monate, aufgeteilt wie folgt:

• Anmeldefrist: 24 Monate
• Datenanalyse: 12 Monate

Experimentelles Design:

Ex-vivo-Analyse der PNA-R8-Silencing-Fähigkeit in Osteosarkom-Proben. Wir werden untersuchen, ob senpPNA-R8 in der Lage ist, in ein dreidimensionales OS-Gewebe einzudringen und seinen Silencing-Effekt auszuüben.

15 OS-Proben werden entweder im Rahmen des IRCCS Galeazzi BioBanca (Ethikausschuss-Genehmigung Nr. 29/INT/2017) oder von neu rekrutierten Patienten in Zusammenarbeit mit dem C.C.O.O.R.R. ausstatten.

Es wird nur aus der Operation stammendes biologisches Abfallmaterial verwendet, ohne dass die Patienten außer der Operation selbst zusätzlich geschädigt werden, und die Studie beinhaltet kein diagnostisches Ziel oder genetisches Profiling der gesammelten Proben.

OS-Proben, die bereits in der BioBanca als gefrorene Proben vorhanden sind, die in flüssigem Stickstoff beim BioRep-Dienstleister (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano) wird verwendet, um die anfänglichen Expressionsniveaus von SENP1 in OS durch RT-qPCR zu bestimmen. Dazu werden Proben homogenisiert, Gesamt-RNA wird extrahiert und RT-qPCR wird durchgeführt, um die SENP1-Expressionsniveaus zu untersuchen.

Die restlichen Proben von 15, frisch gesammelt, werden bis zur Verwendung in physiologischer Lösung aufbewahrt. Die OS-Proben werden in 3-mm3-Stücke geschnitten, in eine 24-Multiwell-Kulturplatte gegeben und ex vivo als organotypische OS-Kulturen sowohl in Normoxie- als auch in Hypoxie-induzierter Mikroumgebung unter Orbitalrotation kultiviert [21-23]. Organotypisches Tumorgewebe behält die Komplexität des ursprünglichen Gewebes bei, wobei Tumorzellen eher von ihrer ursprünglichen Mikroumgebung als von künstlichen Matrizen umgeben sind, und dieses System ist besonders vorteilhaft für das Ex-vivo-Arzneimittelscreening, für die Untersuchung der Arzneimittelaufnahme und molekularer Prozesse. OS-Kulturen werden mit senpPNA-R8 behandelt, und die SENP1-Expression in naiven und PNA-behandelten Proben wird durch RT-qPCR und Immunhistochemie in in Paraffin eingebetteten Schnitten bestimmt. Die Fähigkeit des PNA-R8, in den hypoxischen Kern der OS-Proben einzudringen, wird bewertet: Nach der Inkubation mit scrPNA-R8-Fl werden die Schnitte sofort eingefroren (-80 °C), verarbeitet und durch Immunfluoreszenz analysiert.

Die Proben werden während der gesamten Dauer der Studie im Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare am Istituto Ortopedico Galeazzi analysiert und gelagert. Am Ende der Studie werden alle Restmaterialien vernichtet.