Hæmning af SENP1 til undertrykkelse af OS-vækst og metastase

Baggrund:

Osteosarkom (OS) er den mest almindelige type primær malign knogletumor hos børn og unge. Den samlede overlevelsesrate reduceres dramatisk ved udvikling af metastaser, ofte pulmonale. Solide maligne tumorer, såsom OS, udvikler ofte et hypoxisk mikromiljø, som bidrager til tumorvækst, metastaser, behandlingssvigt og patientdødelighed. Tilpasning til hypoxi, såvel som til andre miljøforhold, er ofte forbundet med modifikationer i den post-transkriptionelle regulering af nøgleeffektorer. Blandt disse udføres SUMOylering af små ubiquitin-lignende modificerende (SUMO) proteiner og vendes dynamisk (deSUMOylation) af Sentrin/SUMO-specifikke proteaser (SENP'er). SENP1, den bedst karakteriserede SENP, er opreguleret i flere tumorer, der er involveret i tumorgenese og tumorprogression. Gennem deSUMOylering fungerer SENP1 som et molekylært nav, der stabiliserer og aktiverer nøgleregulatorfaktorer, såsom hypoxi-inducerbar faktor 1α (HIF1α), zinkfinger E-boks bindende homeobox 1 (ZEB1) og Akt, ansvarlig for tumorcellers tilpasning til hypoksisk mikromiljø, induktion af celleproliferation, invasion og migration og hæmning af apoptose, hvilket bidrager til tumorprogression og metastasering.

HIF1α er hovedtransskriptionsregulatoren for cellulær tilpasning og overlevelse under hypoxiske forhold og bidrager til at øge cellemetastaseringspotentialet. SENP1-medieret HIF1α-deSUMOylering forhindrer HIF1α-nedbrydning af proteasom og aktiverer dermed HIF1α-signalvejen. SENP1 er overudtrykt i OS-celler under hypoksisk tilstand, og siRNA-medieret silencing af SENP1 reducerer tumorcellelevedygtighed, fremmer celleapoptose, reducerer invasivitet og hæmmer epitel-mesenchymal overgangen (EMT).

ZEB1 er involveret i tumorgenese, progression, invasion og metastaser i flere tumorer (f. glioblastom, prostata, lunge, lever og kolorektal). ZEB1-silencing i OS-celler fører til en reduceret caspase-3-aktivitet, NF-KB og iNOS-hæmning, samlet reduceret celleproliferation og øget apoptose. SENP1 knockdown i hepatocellulært karcinom (HCC) celler reducerer ZEB1 og hæmmer EMT].

Akt hyperaktivering er afgørende for opståen og progression af tumorer, inklusive OS. I astrogliomceller er siRNA-medieret hæmning af SENP1 forbundet med Akt-hypophosphorylering ledsaget af hæmning af dets downstream-mål Bcl-xL og cyclinD1 og p21-opregulering, hvilket fører til cellecyklusstop og øget apoptose.

Alt i alt tyder disse undersøgelser på, at SENP1 fungerer som en hub, hvis hæmning afspejler flere mål, hvoraf nogle, dvs. HIF1α, ZEB1, Akt, er nøglefaktorer i tumorprogression og metastase ved både normoksi og hypoxi. Selvom det er kendt effekten af ​​SENP1 på HIF1α i OS, er det rimeligt at antage, at SENP1 kan mediere ZEB1-nedregulering og Akt-inaktivering også i OS. Således er nye SENP1-hæmningsstrategier potentielt effektive terapeutiske tilgange til at blokere OS-vækst og metastase.

SENP1-hæmning kan opnås ved gendæmpning medieret af siRNA'er. Nøgne siRNA'er er imidlertid meget ustabile, og liposombaserede leveringssystemer er dårligt effektive og cytotoksiske både in vitro og in vivo. En lovende tilgang til inhibering af SENP1-ekspression er gendæmpning medieret af peptidnukleinsyrer (PNA), nukleobaseoligomerer med phosphatrygraden erstattet af en pseudopeptidrygrad af gentagne enheder af N-(2-aminoethyl)glycin. På grund af deres unaturlige rygrad er PNA'er definitivt resistente over for både nuklease- og proteaseaktiviteter, danner en mere specifik og stabil binding med det komplementære DNA eller RNA, hvilket muliggør en effektiv og vedvarende lyddæmpende effekt. Selvom PNA-cellepermeabiliteten er meget dårlig, kan den effektivt forbedres ved deres konjugation med cellepenetrerende peptider (CPP). I de sidste år har PNA vist sig som virkelig lovende redskaber til kræftdiagnostik og -terapi, og frem for alt som effektive kandidater til stabil gendæmpning i genterapi.

Rationel og foreløbig undersøgelse:

3 forskellige PNA-sekvenser rettet mod forskellige SENP1 mRNA-regioner vil blive designet og testet. PNA'er vil blive konjugeret til en octa-arginin (R8) CPP, der effektivt medierer den intracellulære levering af PNA'er. Optagelsen vil blive undersøgt med en kodet-sekvens R8- og fluorescein (Fl)-konjugeret PNA (scrPNA-R8-Fl).

En in vitro karakterisering af det designede PNA-CPP's evne til at penetrere intracellulært og til at dæmpe målet SENP1 vil blive udført i cellelinjer af OS.

For at studere PNA-R8-optagelsen i OS-celler vil forskellige OS-cellelinjer (SaOS-2, MG-63, U2OS) med forskelligt invasivt potentiale og alle udtrykker SENP1 og primære humane osteoblaster (hOb) som negativ kontrol for SENP1-ekspression. blive brugt. Efter inkubation med scrPNA-R8-Fl ved forskellige koncentrationer vil optagelsen blive bestemt på konsekutive tidspunkter ved flowcytometri, mens den cytoplasmatiske lokalisering vil blive bekræftet ved fluorescensmikroskopi. Et scrPNA-Fl, der ikke er konjugeret til R8, vil fungere som en negativ kontrol, da det ikke forventes at komme ind i cellen. Cytotoksicitet af scrPNA-R8 vil blive analyseret ved Alamar Blue Cell Viability assay. Lyddæmpningseffektiviteten af ​​de forskellige anti-SENP1 PNA-R8-konjugater (senpPNA-R8) vil blive analyseret i alle cellelinjer i både normoksi og hypoxi (1 % O2, 5 % CO2 og 94 % N2). Den senpPNA-R8-medierede SENP1-dæmpningseffektivitet vil blive vurderet ved RT-qPCR og western-blot (WB). scrPNA-R8 vil tjene som negativ kontrol, mens celler transficeret med siRNA målrettet SENP1 vil tjene som positiv kontrol. I denne del vil den mest effektive lyddæmpende senpPNA-R8-forbindelse blive valgt.

Den senpPNA-R8-medierede nedregulering af HIF1α og potentielt af ZEB1-ekspression og Akt-phosphoryleringshæmninger, som følge af SENP1-hæmning i OS-celler, vil blive analyseret af WB. Således vil reduceret cellelevedygtighed, migration og invasion, induktion af apoptose og EMT-hæmning blive analyseret og sammenlignet med virkningerne i hOb. Cellelevedygtighed vil blive bestemt ved Alamar Blue-assay, hvorimod apoptose vil blive analyseret ved flowcytometri ved farvning af Annexin V og med propidiumiodid. Den resterende migration og invasionsevne vil blive vurderet ved henholdsvis sårhelingsassay og transwell invasionsassay. Nedregulering af vimentin og N-cadherin og opregulering af E-cadherin, EMT-markører og af downstream-målene for ZEB1 (caspase-3, NF-κB) og Akt, (cyclinD1 og Bcl-xL) vil blive bestemt af WB.

In vitro-karakteriseringen af ​​penetrations- og lyddæmpningsevnen af ​​det designede PNA-CPP i OS-cellelinjer er det indledende trin i undersøgelsen. En ex vivo-analyse af PNA-CPP's evne til at trænge ind i et 3D-væv og dæmpe målet SENP i en OS-vævseksplantation fra patienter vil følge.

Mål med undersøgelsen:

Målet med dette projekt er at teste en ny kraftfuld PNA-baseret SENP1-hæmmer, tidligere karakteriseret i en in vitro-model af OS-cellelinjer.

Den mest effektive PNA, konjugeret med et cellegennemtrængeligt CPP, som er i stand til at hæmme OS-cellers levedygtighed og invasivitet i både normoksi og hypoxi gennem SENP1-medieret hæmning af HIF1α, ZEB1 og Akt, vil blive undersøgt for dets evne til at penetrere og tavs SENP1-ekspression i ex vivo humane OS-væv.

Primært mål:

At bestemme PNA-CPP's evne til at trænge ind i et ex vivo tredimensionalt væv af OS, afledt af spildt biologisk materiale opnået under OS-udryddelseskirurgi, og at udøve sin biologiske funktion med at hæmme SENP1 i vævet.

Studere design:

Til denne undersøgelse vil der blive indsamlet spildt biologisk materiale fra osteosarkomudryddelse, som kun omfatter en lille del af den fjernede tumormasse ud over den, der anvendes til histologisk og molekylær diagnose.

15 patienter med primær OS vil blive rekrutteret. Målgruppen vil omfatte patienter indlagt på IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, som vil blive udsat for kirurgisk udryddelse af primær OS.

Studiet vil blive præsenteret for patienter med alder ≥18 år, som også kan rekrutteres i IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca-protokollen (godkendelse af etisk udvalg nr. 29/INT/2017) af kirurgen. Disse patienter vil underskrive to informerede samtykker: et til BioBanca og et til PNA-OS-studiet.

Patienter med alderen <18 år vil desuden blive rekrutteret udover IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca. Disse patienter vil blive betragtet som kvalificerede til undersøgelsen, hvis den juridiske vejleder vil underskrive de informerede samtykker i forhold til PNA-OS-undersøgelsen.

Også prøver af OS, der allerede findes i BioBanca som frosne prøver konserveret i flydende nitrogen hos BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), vil blive brugt. Der vil blive gjort enhver rimelig indsats for at kalde disse patienter til at underskrive et specifikt informeret samtykke i forhold til denne undersøgelse.

Da flere praktiske spørgsmål (f.eks. uegnethed eller lav mængde biologisk materiale) kan forekomme, forestiller vi os muligheden for at rekruttere yderligere patienter indtil opnåelse af 15 komplette prøver.

Undersøgelsen starter efter godkendelse af den etiske komité, og den anslåede varighed er 36 måneder, fordelt på følgende:

• Tidspunkt for tilmelding: 24 måneder
• Dataanalyse: 12 måneder

Eksperimentelt design:

Ex vivo-analyse af PNA-R8-dæmpningsevnen i osteosarkomprøver. Vi vil undersøge, om senpPNA-R8 er i stand til at trænge ind i et tredimensionelt OS-væv og udøve dets lyddæmpende effekt.

15 OS-prøver vil blive indsamlet enten i forbindelse med IRCCS Galeazzi BioBanca (godkendelse af etisk udvalg nr. 29/INT/2017) eller fra nyrekrutterede patienter i samarbejde med C.C.O.O.R.R. udstyre.

Kun spildt biologisk materiale fra kirurgi vil blive brugt uden yderligere skade på patienterne ud over selve operationen, og undersøgelsen involverer ikke noget diagnostisk formål eller genetisk profilering af de indsamlede prøver.

OS-prøver, der allerede eksisterer i BioBanca som frosne prøver konserveret i flydende nitrogen hos BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), vil blive brugt til at bestemme de indledende ekspressionsniveauer af SENP1 i OS ved RT-qPCR. Til dette vil prøver blive homogeniseret, totalt RNA vil blive ekstraheret, og RT-qPCR vil blive udført ved at analysere for SENP1-ekspressionsniveauer.

De resterende prøver ud af 15, frisk indsamlede, vil blive opbevaret i fysiologisk opløsning indtil brug. OS-prøverne vil blive skåret i 3 mm3 stykker, anbragt i en 24-multibrønds kulturplade og dyrket ex vivo som organotypiske OS-kulturer i både normoksi og hypoxi-induceret mikromiljø under orbital rotation [21-23]. Organotypisk tumorvæv opretholder kompleksiteten af ​​det oprindelige væv med tumorceller, der er omgivet af deres oprindelige mikromiljø snarere end kunstige matricer, og dette system er særligt fordelagtigt til ex vivo lægemiddelscreening, til undersøgelse af lægemiddeloptagelse og molekylære processer. OS-kulturer vil blive behandlet med senpPNA-R8, og SENP1-ekspression i naive og PNA-behandlede prøver vil blive bestemt ved RT-qPCR og immunhistokemi i paraffin-indlejrede sektioner. PNA-R8's evne til at trænge ind i den hypoxiske kerne af OS-prøverne vil blive vurderet: efter inkubation med scrPNA-R8-Fl vil sektioner straks blive frosset (-80°C), behandlet og analyseret ved immunfluorescens.

Prøver vil blive analyseret og opbevaret på Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare på Istituto Ortopedico Galeazzi i hele undersøgelsens varighed. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen vil alt restmateriale blive destrueret.