Hämning av SENP1 för undertryckande av OS-tillväxt och metastaser

Bakgrund:

Osteosarkom (OS) är den vanligaste typen av primär malign bentumör hos barn och ungdomar. Den totala överlevnaden minskar dramatiskt genom utvecklingen av metastaser, ofta pulmonella. Fasta maligna tumörer, såsom OS, utvecklar ofta en hypoxisk mikromiljö, vilket bidrar till tumörtillväxt, metastaser, behandlingsmisslyckande och patientdödlighet. Anpassning till hypoxi, såväl som till andra miljöförhållanden, är ofta förknippad med modifieringar i den post-transkriptionella regleringen av nyckeleffektorer. Bland dessa utförs SUMOylering av små ubiquitin-like modifier (SUMO) proteiner och är dynamiskt omvänd (deSUMOylation) av Sentrin/SUMO-specifika proteaser (SENPs). SENP1, den bäst karakteriserade SENP, är uppreglerad i flera tumörer som är involverade i tumörbildning och tumörprogression. Genom deSUMOylering fungerar SENP1 som ett molekylärt nav som stabiliserar och aktiverar viktiga regulatorfaktorer, såsom hypoxi-inducerbar faktor 1α (HIF1α), zinkfinger E-box bindande homeobox 1 (ZEB1), och Akt, ansvarig för tumörcellers anpassning till hypoxisk mikromiljö, induktion av cellproliferation, invasion och migration, och hämning av apoptos, vilket således bidrar till tumörprogression och metastasering.

HIF1α är huvudtranskriptionsregulatorn för cellulär anpassning och överlevnad under hypoxiska förhållanden, och bidrar till att förbättra cellens metastatiska potential. SENP1-medierad HIF1α-deSUMOylering förhindrar HIF1α-nedbrytning av proteasom, vilket aktiverar HIF1α-signalvägen. SENP1 överuttrycks i OS-celler under hypoxiskt tillstånd och siRNA-medierad tystnad av SENP1 minskar tumörcellernas livskraft, främjar cellapoptos, minskar invasiviteten och hämmar epitelial-mesenkymal övergång (EMT).

ZEB1 är involverad i tumörbildning, progression, invasion och metastaser i flera tumörer (t. glioblastom, prostata, lunga, lever och kolorektal). ZEB1-tystnad i OS-celler leder till en minskad kaspas-3-aktivitet, NF-KB och iNOS-hämning, totalt sett minskad cellproliferation och ökad apoptos. SENP1 knockdown i hepatocellulära karcinom (HCC) celler minskar ZEB1 och hämmar EMT].

Akt hyperaktivering är avgörande för uppkomst och progression av tumörer, inklusive OS. I astrogliomceller är siRNA-medierad hämning av SENP1 associerad med Akt hypofosforylering åtföljd av hämning av dess nedströmsmål Bcl-xL och cyclinD1 och p21 uppreglering, vilket leder till cellcykelstopp och ökad apoptos.

Sammantaget tyder dessa studier på att SENP1 fungerar som ett nav vars hämning reflekterar på flera mål av vilka några, dvs. HIF1α, ZEB1, Akt, är nyckelfaktorer i tumörprogression och metastaser vid både normoxi och hypoxi. Även om det är känt effekten av SENP1 på HIF1α i OS, är det rimligt att anta att SENP1 kan förmedla ZEB1-nedreglering och Akt-inaktivering även i OS. Sålunda är nya SENP1-hämningsstrategier potentiellt effektiva terapeutiska metoder för att blockera OS-tillväxt och metastaser.

SENP1-hämning kan uppnås genom gentystnad medierad av siRNA. Emellertid är nakna siRNA mycket instabila och liposombaserade leveranssystem är dåligt effektiva och cytotoxiska både in vitro och in vivo. Ett lovande tillvägagångssätt för hämning av SENP1-uttryck är gentystnad medierad av peptidnukleinsyror (PNA), nukleobasoligomerer med fosfatryggraden ersatt av en pseudopeptidryggrad av upprepade enheter av N-(2-aminoetyl)glycin. På grund av sin onaturliga ryggrad är PNA:er definitivt resistenta mot både nukleas- och proteasaktiviteter, bildar en mer specifik och stabil bindning med det komplementära DNA:t eller RNA:t, vilket möjliggör en effektiv och ihållande tystande effekt. Även om PNA-cellpermeabiliteten är mycket dålig, kan den effektivt förbättras genom deras konjugering med cellpenetrerande peptider (CPP). Under de senaste åren har PNA framstått som riktigt lovande verktyg för cancerdiagnostik och terapi, och framför allt som effektiva kandidater för stabil gentystnad inom genterapi.

Rationell och förstudie:

3 olika PNA-sekvenser riktade mot olika SENP1 mRNA-regioner kommer att designas och testas. PNA kommer att konjugeras till en okta-arginin (R8) CPP som effektivt medierar den intracellulära leveransen av PNA. Upptaget kommer att studeras med en kodad sekvens R8- och fluorescein (Fl)-konjugerad PNA (scrPNA-R8-Fl).

En in vitro karakterisering av förmågan hos den designade PNA-CPP att penetrera intracellulärt och tysta målet SENP1 kommer att utföras i cellinjer av OS.

För att studera PNA-R8-upptaget i OS-celler kommer olika OS-cellinjer (SaOS-2, MG-63, U2OS) med olika invasiv potential och som alla uttrycker SENP1, och primära humana osteoblaster (hOb) som negativ kontroll för SENP1-uttryck, att användas. Efter inkubation med scrPNA-R8-Fl vid olika koncentrationer kommer upptaget att bestämmas vid på varandra följande tidpunkter med flödescytometri, medan den cytoplasmatiska lokaliseringen kommer att bekräftas med fluorescensmikroskopi. En scrPNA-Fl som inte är konjugerad till R8 kommer att fungera som en negativ kontroll, eftersom den inte förväntas komma in i cellen. Cytotoxicitet för scrPNA-R8 kommer att analyseras med Alamar Blue Cell Viability-analys. Tystnadseffektiviteten hos de olika anti-SENP1 PNA-R8-konjugaten (senpPNA-R8) kommer att analyseras i alla cellinjer vid både normoxi och hypoxi (1 % O2, 5 % CO2 och 94 % N2). SenpPNA-R8-medierad SENP1 tystnadseffektivitet kommer att bedömas med RT-qPCR och western-blot (WB). scrPNA-R8 kommer att fungera som negativ kontroll, medan celler transfekterade med siRNA riktad mot SENP1 kommer att fungera som positiv kontroll. I denna del kommer den mest effektiva tystande senpPNA-R8-föreningen att väljas.

Den senpPNA-R8-medierade nedregleringen av HIF1α, och potentiellt av ZEB1-uttryck och Akt-fosforyleringshämningar, som en konsekvens av SENP1-hämning i OS-celler, kommer att analyseras av WB. Således kommer reducerad cellviabilitet, migration och invasion, induktion av apoptos och EMT-hämning att analyseras och jämföras med effekterna i hOb. Cellviabilitet kommer att bestämmas med Alamar Blue-analys, medan apoptos kommer att analyseras genom flödescytometri genom färgning av Annexin V och med propidiumjodid. Den kvarvarande migrationen och invasionsförmågan kommer att bedömas genom sårläkningsanalys respektive transwell-invasionsanalys. Nedreglering av vimentin och N-cadherin och uppreglering av E-cadherin, EMT-markörer och av nedströmsmålen för ZEB1 (kaspas-3, NF-KB) och Akt, (cyclinD1 och Bcl-xL) kommer att bestämmas av WB.

Karakteriseringen in vitro av penetrerings- och tystnadsförmågan hos den designade PNA-CPP i OS-cellinjer är det preliminära steget i studien. En ex vivo-analys av förmågan hos PNA-CPP att penetrera in i en 3D-vävnad och tysta målet SENP i ett OS-vävnadsexplantat från patienter kommer att följa.

Syfte med studien:

Syftet med detta projekt är att testa en ny kraftfull PNA-baserad SENP1-hämmare, som tidigare karakteriserats i en in vitro-modell av OS-cellinjer.

Den mest effektiva PNA, konjugerad med en cellgenomsläpplig CPP, som kan hämma OS-cellers viabilitet och invasivitet i både normoxi och hypoxi genom SENP1-medierad hämning av HIF1α, ZEB1 och Akt, kommer att undersökas för dess förmåga att penetrera och tysta SENP1-uttryck i ex vivo humana OS-vävnader.

Primärt mål:

För att bestämma förmågan hos PNA-CPP att penetrera in i en ex vivo tredimensionell vävnad av OS, härrörande från bortkastat biologiskt material som erhållits under OS-utrotningskirurgi, och att utöva sin biologiska funktion att hämma SENP1 i vävnaden.

Studera design:

För denna studie kommer bortkastat biologiskt material härrörande från osteosarkomutrotningskirurgi att samlas in som endast utgör en liten del av den borttagna tumörmassan förutom den som används för histologisk och molekylär diagnos.

15 patienter med primärt OS kommer att rekryteras. Målgruppen kommer att omfatta patienter inlagda på sjukhus vid IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi som kommer att utsättas för kirurgisk utrotning av primärt OS.

Studien kommer att presenteras för patienter med ålder ≥18 år som också kan rekryteras i IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca-protokoll (godkännande av den etiska kommittén nr 29/INT/2017) av kirurgen. Dessa patienter kommer att underteckna två Informed Consents: ett för BioBanca och ett för PNA-OS-studien.

Patienter med ålder <18 år kommer att rekryteras utöver IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca. Dessa patienter kommer att anses vara kvalificerade för studien om den juridiska handledaren kommer att underteckna de informerade samtyckena avseende PNA-OS-studien.

Även prover av OS som redan finns i BioBanca som frysta prover konserverade i flytande kväve hos BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), kommer att användas. Alla rimliga ansträngningar kommer att göras för att kalla dessa patienter att underteckna ett specifikt informerat samtycke i förhållande till denna studie.

Eftersom flera praktiska frågor (t.ex. olämplighet eller låg mängd biologiskt material) kan förekomma, föreställer vi oss möjligheten att rekrytera ytterligare patienter tills 15 fullständiga prover uppnåtts.

Studien kommer att starta efter godkännande av den etiska kommittén och den beräknade varaktigheten är 36 månader, uppdelad enligt följande:

• Tidpunkt för anmälan: 24 månader
• Dataanalys: 12 månader

Experimentell design:

Ex vivo-analys av PNA-R8-dämpningsförmågan i osteosarkomprover. Vi kommer att undersöka om senpPNA-R8 kan tränga in i en tredimensionell OS-vävnad och utöva sin tystande effekt.

15 OS-prover kommer att samlas in antingen inom ramen för IRCCS Galeazzi BioBanca (godkännande av den etiska kommittén nr 29/INT/2017) eller från nyrekryterade patienter, i samarbete med C.C.O.O.R.R. utrusta.

Endast bortkastat biologiskt material som härrör från kirurgi kommer att användas utan ytterligare skada på patienterna förutom själva operationen och studien involverar inte något diagnostiskt syfte eller genetisk profilering av de insamlade proverna.

OS-prover, som redan finns i BioBanca som frysta prover konserverade i flytande kväve hos BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), kommer att användas för att bestämma de initiala uttrycksnivåerna för SENP1 i OS med RT-qPCR. För detta kommer prover att homogeniseras, totalt RNA kommer att extraheras och RT-qPCR kommer att utföras med analys av SENP1-expressionsnivåer.

De återstående proverna av 15, nysamlade, kommer att bevaras i fysiologisk lösning fram till användning. OS-proverna kommer att skäras i 3 mm3 bitar, placeras i en 24-multibrunnsodlingsplatta och odlas ex vivo som organotypiska OS-kulturer i både normoxi- och hypoxiinducerad mikromiljö under orbital rotation [21-23]. Organotypisk tumörvävnad bibehåller komplexiteten hos den ursprungliga vävnaden med tumörceller som omges av sin ursprungliga mikromiljö snarare än artificiella matriser och detta system är särskilt fördelaktigt för ex vivo läkemedelsscreening, för att studera läkemedelsupptag och molekylära processer. OS-kulturer kommer att behandlas med senpPNA-R8, och SENP1-uttryck i naiva och PNA-behandlade prover kommer att bestämmas med RT-qPCR och immunhistokemi i paraffininbäddade sektioner. Förmågan hos PNA-R8 att penetrera i den hypoxiska kärnan av OS-proverna kommer att bedömas: efter inkubation med scrPNA-R8-Fl kommer sektioner att omedelbart frysas (-80°C), bearbetas och analyseras med immunfluorescens.

Prover kommer att analyseras och lagras på Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare vid Istituto Ortopedico Galeazzi under hela studiens varaktighet. I slutet av studien kommer varje restmaterial att förstöras.