SENP1:n esto käyttöjärjestelmän kasvun ja metastaasien estämiseksi

Tausta:

Osteosarkooma (OS) on yleisin lasten ja nuorten primaarinen pahanlaatuinen luukasvain. Kokonaiseloonjäämisaste laskee dramaattisesti metastaasien, usein keuhkoihin, kehittymisen vuoksi. Kiinteät pahanlaatuiset kasvaimet, kuten OS, kehittävät usein hypoksisen mikroympäristön, mikä edistää kasvaimen kasvua, etäpesäkkeitä, hoidon epäonnistumista ja potilaiden kuolleisuutta. Sopeutuminen hypoksiaan, kuten myös muihin ympäristöolosuhteisiin, liittyy usein modifikaatioihin avainefektorien transkription jälkeisessä säätelyssä. Näistä SUMOylaation suorittavat pienet ubiquitiinin kaltaiset modifioijaproteiinit (SUMO) ja Sentrin/SUMO-spesifiset proteaasit (SENP:t) kääntävät sen dynaamisesti (deSUMOylaatio). SENP1, parhaiten karakterisoitu SENP, on lisääntynyt monissa kasvaimissa, jotka ovat osallisena kasvainten muodostumisessa ja kasvaimen etenemisessä. DeSUMOylaation kautta SENP1 toimii molekyylikeskuksena, joka stabiloi ja aktivoi keskeisiä säätelytekijöitä, kuten hypoksian aiheuttamaa tekijää 1α (HIF1α), sinkkisormen E-laatikkoa sitovaa homeobox 1:tä (ZEB1) ja Akt:a, joka vastaa kasvainsolujen sopeutumisesta hypoksiseen. mikroympäristö, soluproliferaation, invaasion ja migraation induktio ja apoptoosin estäminen, mikä myötävaikuttaa kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeisiin.

HIF1α on päätranskription säätelijä solujen mukautumiseen ja eloonjäämiseen hypoksisissa olosuhteissa, ja se edistää solujen metastaattisen potentiaalin lisäämistä. SENP1-välitteinen HIF1α deSUMOylaatio estää HIF1α:n hajoamisen proteasomin vaikutuksesta, mikä aktivoi HIF1α-signalointireitin. SENP1 yliekspressoituu OS-soluissa hypoksisessa tilassa ja siRNA-välitteinen SENP1:n hiljentäminen vähentää kasvainsolujen elinkelpoisuutta, edistää solujen apoptoosia, vähentää invasiivisuutta ja estää epiteeli-mesenkymaalista siirtymää (EMT).

ZEB1 osallistuu tuumorigeneesiin, etenemiseen, invaasioon ja metastaaseihin useissa kasvaimissa (esim. glioblastooma, eturauhanen, keuhkot, maksa ja kolorektaali). ZEB1:n hiljentäminen OS-soluissa johtaa vähentyneeseen kaspaasi-3-aktiivisuuteen, NF-KB:n ja iNOS:n estoon, yleisesti vähentyneeseen solujen lisääntymiseen ja lisääntyneeseen apoptoosiin. SENP1:n tuhoutuminen hepatosellulaarisessa karsinoomasoluissa (HCC) vähentää ZEB1:tä ja estää EMT:tä].

Akt-hyperaktivaatio on välttämätöntä kasvainten, mukaan lukien OS, syntymiselle ja etenemiselle. Astrolioomasoluissa siRNA-välitteinen SENP1:n esto liittyy Akt-hypofosforylaatioon, johon liittyy sen alavirran kohteen Bcl-xL:n ja syklinD1:n ja p21:n ylössäätelyn estäminen, mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen ja lisääntyneeseen apoptoosiin.

Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset viittaavat siihen, että SENP1 toimii keskuksena, jonka esto heijastuu useisiin kohteisiin, joista osa, esim. HIF1α, ZEB1, Akt ovat avaintekijöitä kasvaimen etenemisessä ja etäpesäkkeissä sekä normoksiassa että hypoksiassa. Vaikka tiedetään SENP1:n vaikutus HIF1α:aan käyttöjärjestelmässä, on kohtuullista olettaa, että SENP1 saattaa välittää ZEB1:n alasäätelyä ja Akt-inaktivaatiota myös käyttöjärjestelmässä. Siten uudet SENP1:n estostrategiat ovat mahdollisesti tehokkaita terapeuttisia lähestymistapoja käyttöjärjestelmän kasvun ja etäpesäkkeiden estämiseksi.

SENP1:n esto voidaan saavuttaa siRNA:iden välittämällä geenin hiljentämisellä. Paljaat siRNA:t ovat kuitenkin erittäin epästabiileja ja liposomipohjaiset kuljetusjärjestelmät ovat heikosti tehokkaita ja sytotoksisia sekä in vitro että in vivo. Lupaava lähestymistapa SENP1:n ilmentymisen estämiseen on geenin hiljentäminen, jota välittävät peptidinukleiinihapot (PNA), nukleoemäsoligomeerit, joiden fosfaattirunko on korvattu N-(2-aminoetyyli)glysiinin toistuvista yksiköistä koostuvalla pseudopeptidirungolla. Epäluonnollisen runkonsa vuoksi PNA:t ovat lopullisesti resistenttejä sekä nukleaasi- että proteaasiaktiivisuudelle, muodostavat spesifisemmän ja vakaamman sitoutumisen komplementaarisen DNA:n tai RNA:n kanssa, mikä mahdollistaa tehokkaan ja pysyvän hiljennysvaikutuksen. Vaikka PNA-solujen läpäisevyys on erittäin huono, sitä voidaan tehokkaasti parantaa konjugoimalla ne soluun tunkeutuvien peptidien (CPP) kanssa. Viime vuosina PNA on noussut todella lupaaviksi apuvälineiksi syövän diagnosoinnissa ja hoidossa ja ennen kaikkea tehokkaina ehdokkaina geeniterapian vakaaseen geenien vaimentamiseen.

Rationaalinen ja alustava tutkimus:

Suunnitellaan ja testataan kolme erilaista PNA-sekvenssiä, jotka kohdistuvat eri SENP1-mRNA-alueisiin. PNA:t konjugoidaan okta-arginiini (R8) CPP:hen, joka välittää tehokkaasti PNA:iden solunsisäistä kulkeutumista. Sisäänottoa tutkitaan sekoitetulla sekvenssillä R8- ja fluoreseiiniin (Fl) konjugoidulla PNA:lla (scrPNA-R8-Fl).

Suunnitellun PNA-CPP:n kyvystä tunkeutua solunsisäiseen ja hiljentää kohdeSENP1 suoritetaan in vitro karakterisointi OS:n solulinjoissa.

PNA-R8:n oton tutkimiseksi OS-soluissa käytetään erilaisia ​​OS-solulinjoja (SaOS-2, MG-63, U2OS), joilla on erilainen invasiivinen potentiaali ja jotka kaikki ilmentävät SENP1:tä, sekä ihmisen primaariset osteoblastit (hOb) negatiivisena kontrollina SENP1:n ilmentymiselle. käyttää. Inkuboinnin jälkeen scrPNA-R8-Fl:n kanssa eri pitoisuuksilla sisäänotto määritetään peräkkäisinä ajankohtina virtaussytometrialla, kun taas sytoplasminen sijainti varmistetaan fluoresenssimikroskopialla. ScrPNA-Fl, jota ei ole konjugoitu R8:aan, toimii negatiivisena kontrollina, koska sen ei odoteta pääsevän soluun. ScrPNA-R8:n sytotoksisuus määritetään Alamar Blue Cell Viability -määrityksellä. Erilaisten anti-SENP1 PNA-R8 -konjugaattien (senpPNA-R8) hiljennystehokkuus määritetään kaikissa solulinjoissa sekä normoksiassa että hypoksiassa (1 % O2, 5 % CO2 ja 94 % N2). SenpPNA-R8-välitteinen SENP1-hiljennysteho arvioidaan RT-qPCR:llä ja Western-blotilla (WB). scrPNA-R8 toimii negatiivisena kontrollina, kun taas solut, jotka on transfektoitu SENP1:een kohdistuvalla siRNA:lla, toimivat positiivisena kontrollina. Tässä osassa valitaan tehokkain hiljentävä senpPNA-R8-yhdiste.

WB määrittää senpPNA-R8-välitteisen HIF1a:n ja mahdollisesti ZEB1:n ilmentymisen ja Akt-fosforylaatioinhiboitumisen, joka johtuu SENP1:n estämisestä OS-soluissa. Siten vähentynyt solujen elinkelpoisuus, migraatio ja invaasio, apoptoosin induktio ja EMT:n esto määritetään ja niitä verrataan vaikutuksiin hOb:ssa. Solujen elinkelpoisuus määritetään Alamar Blue -määrityksellä, kun taas apoptoosi määritetään virtaussytometrialla värjäämällä anneksiini V:llä ja propidiumjodidilla. Jäännösmigraatio- ja tunkeutumiskyky arvioidaan haavan paranemismäärityksellä ja transwell-invaasiomäärityksellä, vastaavasti. WB määrittää vimentiinin ja N-kadheriinin alenemisen sekä E-kadheriinin, EMT-markkerien ja ZEB1:n (kaspaasi-3, NF-κB) ja Akt:n (cyclinD1 ja Bcl-xL) myötävirtakohteiden lisääntymisen.

Suunnitellun PNA-CPP:n tunkeutumis- ja vaimennuskyvyn in vitro karakterisointi OS-solulinjoissa on tutkimuksen alustava vaihe. Seuraa ex vivo -analyysi PNA-CPP:n kyvystä tunkeutua 3D-kudokseen ja hiljentää kohde-SENP potilaiden OS-kudoseksplantissa.

Tutkimuksen tavoitteet:

Tämän projektin tavoitteena on testata uutta tehokasta PNA-pohjaista SENP1-estäjää, joka on aiemmin karakterisoitu OS-solulinjojen in vitro -mallissa.

Tehokkainta PNA:ta, joka on konjugoitu solua läpäisevään CPP:hen, joka pystyy estämään OS-solujen elinkelpoisuutta ja invasiivisuutta sekä normoksiassa että hypoksiassa SENP1-välitteisen HIF1α:n, ZEB1:n ja Akt:n estämisen kautta, tutkitaan sen kykyä tunkeutua ja hiljentää SENP1:n ilmentymisen ex vivo ihmisen käyttöjärjestelmän kudoksissa.

Ensisijainen tavoite:

Määrittää PNA-CPP:n kyvyn tunkeutua OS:n ex vivo kolmiulotteiseen kudokseen, joka on peräisin OS-hävitysleikkauksen aikana saadusta hukkaan biologisesta materiaalista, ja käyttää biologista tehtäväänsä SENP1:n estämisessä kudoksessa.

Opintojen suunnittelu:

Tätä tutkimusta varten kerätään osteosarkooman häätöleikkauksesta peräisin olevaa hukkaantunutta biologista materiaalia, joka käsittää vain pienen osan poistetusta kasvainmassasta muusta kuin histologiseen ja molekyylidiagnostiikkaan käytetystä.

Rekrytoidaan 15 potilasta, joilla on ensisijainen käyttöjärjestelmä. Kohderyhmänä ovat IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzissa sairaalahoidossa olevat potilaat, joille tehdään primaarisen OS:n kirurginen hävittäminen.

Tutkimus esitellään ≥18-vuotiaille potilaille, jotka voidaan ottaa mukaan myös IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca -protokollaan (eettisen komitean hyväksyntä n. 29/INT/2017) kirurgin toimesta. Nämä potilaat allekirjoittavat kaksi tietoista suostumusta: yhden BioBancaa ja toisen PNA-OS-tutkimusta varten.

IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBancan lisäksi rekrytoidaan alle 18-vuotiaita potilaita. Nämä potilaat katsotaan kelvollisiksi tutkimukseen, jos lainopillinen ohjaaja allekirjoittaa PNA-OS-tutkimukseen liittyvän tietoisen suostumuksen.

Myös BioBancassa jo olemassa olevia käyttöjärjestelmän näytteitä pakastettuina näytteinä, jotka on säilytetty nestetypessä BioRep Service-Providerissa (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), käytetään. Näille potilaille tehdään kaikki mahdollinen, jotta he allekirjoittaisivat tähän tutkimukseen liittyvän tietoon perustuvan suostumuksen.

Koska monet käytännön asiat (esim. sopimattomuus tai vähäinen biologisen materiaalin määrä) voi ilmetä, kuvittelemme mahdollisuuden rekrytoida lisää potilaita, kunnes 15 täydellistä näytettä on saatu.

Tutkimus alkaa eettisen toimikunnan hyväksynnän jälkeen ja sen arvioitu kesto on 36 kuukautta jaettuna seuraavasti:

• Ilmoittautumisaika: 24 kuukautta
• Tietojen analysointi: 12 kuukautta

Kokeellinen suunnittelu:

Ex vivo -analyysi PNA-R8:n hiljennyskyvystä osteosarkoomanäytteissä. Tutkimme, pystyykö senpPNA-R8 tunkeutumaan kolmiulotteiseen käyttöjärjestelmän kudokseen ja saamaan aikaan sen hiljennysvaikutuksen.

15 käyttöjärjestelmänäytettä kerätään joko IRCCS Galeazzi BioBancan yhteydessä (eettisen komitean hyväksyntä nro 29/INT/2017) tai uusilta rekrytoiduilta potilailta yhteistyössä C.C.O.O.R.R. varustaa.

Vain leikkauksesta saatua biologista materiaalia käytetään hukkaan ilman potilaille aiheutuvaa muuta haittaa kuin itse leikkaus, eikä tutkimukseen liity diagnostista tavoitetta tai kerättyjen näytteiden geneettistä profilointia.

Käyttöjärjestelmänäytteet, jotka ovat jo olemassa BioBancassa pakastettuina näytteinä, jotka on säilytetty nestetypessä BioRep Service-Providerissa (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), käytetään SENP1:n alkuperäisten ilmentymistasojen määrittämiseen käyttöjärjestelmässä RT-qPCR:llä. Tätä varten näytteet homogenoidaan, kokonais-RNA uutetaan ja RT-qPCR suoritetaan SENP1:n ilmentymistasojen määrittämiseksi.

Loput 15 näytteestä, juuri kerätyt, säilytetään fysiologisessa liuoksessa käyttöön asti. OS-näytteet leikataan 3 mm3:n paloiksi, asetetaan 24-monikuoppaiselle viljelylevylle ja viljellään ex vivo organotyyppisinä OS-viljelminä sekä normoksian että hypoksian aiheuttamassa mikroympäristössä kiertoradalla [21-23]. Organotyyppinen kasvainkudos säilyttää alkuperäisen kudoksen monimutkaisuuden, kun kasvainsoluja ympäröi niiden alkuperäinen mikroympäristö keinotekoisten matriisien sijasta, ja tämä järjestelmä on erityisen edullinen ex vivo -lääkeseulonnassa, lääkeaineen sisäänoton ja molekyyliprosessien tutkimisessa. OS-viljelmiä käsitellään senpPNA-R8:lla, ja SENP1:n ilmentyminen naiiveissa ja PNA-käsitellyissä näytteissä määritetään RT-qPCR:llä ja immunohistokemialla parafiiniin upotetuissa osissa. PNA-R8:n kyky tunkeutua OS-näytteiden hypoksiseen ytimeen arvioidaan: scrPNA-R8-Fl:n kanssa inkuboinnin jälkeen leikkeet jäädytetään välittömästi (-80 °C), käsitellään ja analysoidaan immunofluoresenssilla.

Näytteet analysoidaan ja säilytetään Laboratorio di Biochimica Sperimentalessa e Biologia Molecolaressa Istituto Ortopedico Galeazzissa koko tutkimuksen ajan. Tutkimuksen lopussa kaikki jäännösmateriaali tuhotaan.