A SENP1 gátlása az operációs rendszer növekedésének és metasztázisának elnyomására

Háttér:

Az osteosarcoma (OS) az elsődleges rosszindulatú csontdaganat leggyakoribb típusa gyermekeknél és serdülőknél. Az általános túlélési arányt drámaian csökkenti a metasztázisok kialakulása, gyakran tüdőben. A szilárd rosszindulatú daganatok, mint például az OS, gyakran hipoxiás mikrokörnyezetet alakítanak ki, ami hozzájárul a daganat növekedéséhez, metasztázisokhoz, a kezelés sikertelenségéhez és a betegek mortalitásához. A hipoxiához, valamint más környezeti feltételekhez való alkalmazkodás gyakran a kulcsfontosságú effektorok transzkripciós szabályozásának módosulásával jár. Ezek közül a SUMOilációt kis ubiquitin-szerű módosító (SUMO) fehérjék hajtják végre, és dinamikusan megfordítják (deSUMOiláció) a Sentrin/SUMO-specifikus proteázok (SENP-k). A SENP1, a legjobban jellemezhető SENP, több tumorban is felszabályozott, amelyek részt vesznek a daganatképződésben és a tumor progressziójában. A deSUMOiláció révén a SENP1 molekuláris csomópontként működik, amely stabilizálja és aktiválja a kulcsfontosságú szabályozó tényezőket, mint például a hipoxia által indukálható 1α faktor (HIF1α), a cink ujj E-box-kötő homeobox 1 (ZEB1) és az Akt, amely felelős a tumorsejtek hipoxiához való alkalmazkodásáért. mikrokörnyezet, sejtproliferáció, invázió és migráció indukálása, valamint az apoptózis gátlása, így hozzájárulva a tumor progressziójához és metasztázisához.

A HIF1α a sejtek adaptációjának és túlélésének fő transzkripciós szabályozója hipoxiás körülmények között, és hozzájárul a sejtek metasztatikus potenciáljának fokozásához. A SENP1 által közvetített HIF1α deSUMOiláció megakadályozza a HIF1α proteaszóma általi lebomlását, így aktiválja a HIF1α jelátviteli útvonalat. A SENP1 túlzottan expresszálódik az OS sejtekben hipoxiás állapotban, és a SENP1 siRNS-közvetített elnémítása csökkenti a tumorsejtek életképességét, elősegíti a sejt apoptózisát, csökkenti az invazivitást és gátolja az epiteliális-mezenchimális átmenetet (EMT).

A ZEB1 részt vesz a tumorgenezisben, a progresszióban, az invázióban és a metasztázisokban számos daganatban (pl. glioblasztóma, prosztata, tüdő, máj és kolorektális). A ZEB1 elnémítása az OS sejtekben csökkent kaszpáz-3 aktivitáshoz, NF-κB és iNOS gátláshoz, összességében csökkent sejtproliferációhoz és fokozott apoptózishoz vezet. A SENP1 leütése a hepatocelluláris karcinóma (HCC) sejtekben csökkenti a ZEB1-et és gátolja az EMT-t].

Az Akt hiperaktiváció elengedhetetlen a daganatok kialakulásához és progressziójához, beleértve az OS-t is. Asztroglioma sejtekben a SENP1 siRNS által közvetített gátlása az Akt hipofoszforilációjához kapcsolódik, amit a Bcl-xL és a cyclinD1 és a p21 upregulációjának gátlása kísér, ami sejtciklus leálláshoz és fokozott apoptózishoz vezet.

Összességében ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy a SENP1 központként működik, amelynek gátlása több célpontra is reflektál, amelyek közül néhány, pl. A HIF1α, ZEB1, Akt kulcsfontosságú tényezők a tumor progressziójában és metasztázisában mind normoxiában, mind hipoxiában. Bár ismert a SENP1 hatása a HIF1α-ra operációs rendszerben, ésszerű feltételezni, hogy a SENP1 közvetítheti a ZEB1 leszabályozását és az Akt inaktiválását az operációs rendszerben is. Így az új SENP1 gátlási stratégiák potenciálisan hatékony terápiás megközelítések az operációs rendszer növekedésének és metasztázisának blokkolására.

A SENP1 gátlása siRNS-ek által közvetített géncsendesítéssel érhető el. A csupasz siRNS-ek azonban nagyon instabilak, és a liposzóma-alapú szállítórendszerek gyengén hatékonyak és citotoxikusak mind in vitro, mind in vivo. A SENP1 expresszió gátlásának ígéretes megközelítése a peptid nukleinsavak (PNA), nukleobázis oligomerek által közvetített géncsendesítés, amelynek foszfátvázát az N-(2-aminoetil)-glicin ismétlődő egységeiből álló pszeudopeptid váz helyettesíti. Természetellenes vázuk miatt a PNS-ek végérvényesen rezisztensek mind a nukleáz-, mind a proteázaktivitásokkal szemben, specifikusabb és stabilabb kötést képeznek a komplementer DNS-sel vagy RNS-sel, ami hatékony és tartós elnémító hatást tesz lehetővé. Bár a PNA-sejtek permeabilitása nagyon gyenge, hatékonyan fokozható a sejtbehatoló peptidekkel (CPP) való konjugálással. Az elmúlt években a PNA valóban ígéretes eszközzé vált a rák diagnosztizálásában és terápiájában, és mindenekelőtt a génterápia stabil géncsendesítésének hatékony jelöltjeként.

Racionális és előzetes tanulmány:

Három különböző SENP1 mRNS régiót célzó PNA szekvenciát tervezünk és tesztelünk. A PNA-k konjugálnak egy okta-arginin (R8) CPP-hez, amely hatékonyan közvetíti a PNA-k intracelluláris szállítását. A felvételt egy kódolt szekvenciájú R8- és fluoreszcein (Fl)-konjugált PNA-val (scrPNA-R8-Fl) vizsgáljuk.

In vitro jellemzik a tervezett PNA-CPP azon képességét, hogy behatolnak az intracellulárisan és elnémítják a cél SENP1-et az operációs rendszer sejtvonalaiban.

A PNA-R8 felvételének tanulmányozásához OS sejtekben a különböző invazív potenciállal rendelkező és a SENP1-et expresszáló különböző operációs rendszer sejtvonalakat (SaOS-2, MG-63, U2OS), valamint a primer humán oszteoblasztokat (hOb) a SENP1 expresszió negatív kontrolljaként használják. használva lenni. Különböző koncentrációjú scrPNA-R8-Fl-vel történő inkubálást követően a felvételt egymást követő időpontokban áramlási citometriával határozzuk meg, míg a citoplazmatikus lokalizációt fluoreszcens mikroszkóppal igazoljuk. Az R8-hoz nem konjugált scrPNA-Fl negatív kontrollként fog működni, mivel várhatóan nem jut be a sejtbe. Az scrPNA-R8 citotoxicitását Alamar Blue Cell Viability assay-vel vizsgáljuk. A különböző anti-SENP1 PNA-R8 konjugátumok (senpPNA-R8) elnémítási hatékonyságát minden sejtvonalban megvizsgálják, mind normoxiában, mind hipoxiában (1% O2, 5% CO2 és 94% N2). A senpPNA-R8 által közvetített SENP1 elnémítási hatékonyságot RT-qPCR és Western-blot (WB) segítségével értékeljük. Az scrPNA-R8 negatív kontrollként, míg a SENP1-et célzó siRNS-sel transzfektált sejtek pozitív kontrollként szolgálnak. Ebben a részben a leghatékonyabb hangtompító senpPNA-R8 vegyület kerül kiválasztásra.

A HIF1α senpPNA-R8 által közvetített leszabályozását, és potenciálisan a ZEB1 expresszióját és az Akt foszforiláció gátlását, ami a SENP1 gátlás következménye az OS sejtekben, WB-vel vizsgáljuk. Így a csökkent sejtek életképességét, migrációját és invázióját, az apoptózis indukálását és az EMT-gátlást megvizsgáljuk, és összehasonlítjuk a hOb-ban kifejtett hatásokkal. A sejtek életképességét Alamar Blue vizsgálattal határozzuk meg, míg az apoptózist áramlási citometriával, az Annexin V és propidium-jodid festésével. A maradék migrációs és inváziós képességet sebgyógyulási vizsgálattal, illetve transzwell inváziós vizsgálattal értékeljük. A vimentin és az N-cadherin, valamint az E-cadherin, az EMT markerek, valamint a ZEB1 (kaszpáz-3, NF-κB) és Akt (ciklinD1 és Bcl-xL) downstream célpontjainak felszabályozását a WB határozza meg.

A tervezett PNA-CPP penetrációs és némító képességének in vitro jellemzése OS sejtvonalakban a vizsgálat előzetes lépése. A PNA-CPP azon képességének ex vivo elemzése következik, hogy képes-e behatolni egy 3D szövetbe, és elnémítja a cél SENP-t a betegek OS szövetexplantátumában.

A tanulmány céljai:

A projekt célja egy új, erőteljes PNA-alapú SENP1 inhibitor tesztelése, amelyet korábban OS sejtvonalak in vitro modelljében jellemeztek.

A leghatékonyabb, sejtpermeábilis CPP-vel konjugált PNA-t, amely képes gátolni az OS-sejtek életképességét és invazivitását mind normoxiában, mind hipoxiában a HIF1α, ZEB1 és Akt SENP1 által közvetített gátlása révén, megvizsgáljuk, hogy mennyire képes behatolni és behatolni. elnémítja a SENP1 expresszióját ex vivo emberi operációs rendszer szöveteiben.

Elsődleges cél:

Meghatározni a PNA-CPP azon képességét, hogy behatoljon az OS ex vivo háromdimenziós szövetébe, amely az OS eradikációs műtét során nyert elpazarolt biológiai anyagból származik, és kifejtse biológiai funkcióját, a SENP1 gátlását a szöveten belül.

Dizájnt tanulni:

Ehhez a vizsgálathoz az osteosarcoma eradikációs műtétből származó, elpazarolt biológiai anyagot gyűjtik össze, amely az eltávolított tumortömegnek csak kis hányadát teszi ki, kivéve a szövettani és molekuláris diagnózishoz használtat.

15 elsődleges OS-ben szenvedő beteget vesznek fel. A célcsoport az IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi kórházban kezelt betegekből áll, akiket az elsődleges OS műtéti felszámolásának vetnek alá.

A vizsgálatot 18 éven felüli betegeknek mutatják be, akiket a sebész az IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca protokolljába is bevonhat (etikai bizottsági jóváhagyás n. 29/INT/2017). Ezek a betegek két tájékozott hozzájárulást írnak alá: egyet a BioBanca, egyet pedig a PNA-OS vizsgálathoz.

Az IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca mellett 18 év alatti betegeket is toboroznak. Ezeket a betegeket akkor tekintik jogosultnak a vizsgálatban való részvételre, ha a jogi oktató aláírja a PNA-OS vizsgálathoz kapcsolódó tájékoztatáson alapuló hozzájárulást.

Szintén a BioBancában már meglévő operációs rendszer mintái fagyasztott mintákként, amelyeket folyékony nitrogénben tároltak a BioRep Service-Providernél (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano) kerül felhasználásra. Minden ésszerű erőfeszítést megtesznek annak érdekében, hogy felhívják ezeket a betegeket, hogy írják alá a vizsgálattal kapcsolatos konkrét beleegyező nyilatkozatukat.

Mivel számos gyakorlati probléma (pl. alkalmatlanság vagy kevés biológiai anyag) előfordulhat, további betegek toborzását képzeljük el 15 teljes minta eléréséig.

A tanulmány az Etikai Bizottság jóváhagyását követően indul, és a becsült időtartam 36 hónap, a következők szerint osztva:

• Jelentkezési idő: 24 hónap
• Adatelemzés: 12 hónap

Kísérleti terv:

A PNA-R8 csendesítő képesség ex vivo elemzése osteosarcoma mintákban. Megvizsgáljuk, hogy a senpPNA-R8 képes-e behatolni egy háromdimenziós operációs rendszer szövetébe, és kifejteni némító hatását.

15 operációs rendszer mintát gyűjtenek vagy az IRCCS Galeazzi BioBanca keretében (etikai bizottság jóváhagyása n. 29/INT/2017), vagy az újonnan felvett betegektől a C.C.O.O.R.R. együttműködésben. felszerelni.

Csak a műtétből származó, elpazarolt biológiai anyagot használjuk fel magán a műtéten kívül a betegeket érő további károsodás nélkül, és a vizsgálat nem foglal magában semmilyen diagnosztikai célt vagy a begyűjtött minták genetikai profilozását.

OS minták, amelyek már léteznek a BioBancában fagyasztott mintákként, amelyeket folyékony nitrogénben tárolnak a BioRep Service-Providernél (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), a SENP1 kezdeti expressziós szintjének meghatározására szolgál az operációs rendszerben RT-qPCR segítségével. Ehhez a mintákat homogenizálják, a teljes RNS-t kivonják, és RT-qPCR-t végeznek a SENP1 expressziós szint meghatározására.

A fennmaradó 15 mintából frissen gyűjtött mintát fiziológiás oldatban tároljuk felhasználásig. Az OS-mintákat 3 mm3-es darabokra vágjuk, 24 többüregű tenyésztőlemezre helyezzük, és ex vivo organotipikus OS-tenyészetként tenyésztjük mind normoxia, mind hipoxia által kiváltott mikrokörnyezetben orbitális rotáció mellett [21-23]. Az organotipikus daganatszövet megőrzi az eredeti szövet komplexitását, a daganatsejteket nem mesterséges mátrixok, hanem eredeti mikrokörnyezetük veszi körül, és ez a rendszer különösen előnyös ex vivo gyógyszerszűréshez, gyógyszerfelvétel és molekuláris folyamatok vizsgálatához. Az OS tenyészeteket senpPNA-R8-cal kezeljük, és a SENP1 expresszióját a naiv és PNA-val kezelt mintákban RT-qPCR-rel és immunhisztokémiával határozzuk meg a paraffinba ágyazott metszetekben. Felmérik a PNA-R8 azon képességét, hogy behatoljon az OS-minták hipoxiás magjába: scrPNA-R8-Fl-vel történő inkubálás után a metszeteket azonnal lefagyasztják (-80 °C), feldolgozzák és immunfluoreszcenciával elemzik.

A mintákat az Istituto Ortopedico Galeazzi Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare-ban elemzik és tárolják a vizsgálat teljes időtartama alatt. A vizsgálat végén minden visszamaradt anyag megsemmisül.