Inhibition de SENP1 pour la suppression de la croissance du système d'exploitation et des métastases

Arrière-plan:

L'ostéosarcome (OS) est le type le plus courant de tumeur osseuse maligne primaire chez les enfants et les adolescents. Le taux de survie global est considérablement réduit par le développement de métastases, souvent pulmonaires. Les tumeurs malignes solides, telles que l'OS, développent souvent un microenvironnement hypoxique, qui contribue à la croissance tumorale, aux métastases, à l'échec du traitement et à la mortalité des patients. L'adaptation à l'hypoxie, ainsi qu'à d'autres conditions environnementales, est souvent associée à des modifications de la régulation post-transcriptionnelle des effecteurs clés. Parmi celles-ci, la SUMOylation est réalisée par de petites protéines modificatrices de type ubiquitine (SUMO) et est dynamiquement inversée (déSUMOylation) par les protéases spécifiques de la Sentrine/SUMO (SENP). SENP1, le SENP le mieux caractérisé, est régulé positivement dans de multiples tumeurs impliquées dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Grâce à la déSUMOylation, SENP1 agit comme un hub moléculaire qui stabilise et active les principaux facteurs régulateurs, tels que le facteur 1α inductible par l'hypoxie (HIF1α), l'homéobox 1 de liaison à la boîte E à doigt de zinc (ZEB1) et Akt, responsable de l'adaptation des cellules tumorales à l'hypoxie. microenvironnement, induction de la prolifération cellulaire, invasion et migration, et inhibition de l'apoptose, contribuant ainsi à la progression tumorale et aux métastases.

HIF1α est le maître régulateur transcriptionnel de l'adaptation cellulaire et de la survie dans des conditions hypoxiques, et contribue à augmenter le potentiel métastatique cellulaire. La déSUMOylation de HIF1α médiée par SENP1 empêche la dégradation de HIF1α par le protéasome, activant ainsi la voie de signalisation HIF1α. SENP1 est surexprimé dans les cellules OS dans des conditions hypoxiques et le silençage médié par l'ARNsi de SENP1 diminue la viabilité des cellules tumorales, favorise l'apoptose cellulaire, réduit le caractère invasif et inhibe la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT).

ZEB1 est impliqué dans la tumorigenèse, la progression, l'invasion et les métastases dans plusieurs tumeurs (par ex. glioblastome, prostate, poumon, foie et colorectal). Le silençage de ZEB1 dans les cellules OS entraîne une réduction de l'activité de la caspase-3, une inhibition de NF-κB et de l'iNOS, une prolifération cellulaire globalement réduite et une apoptose accrue. L'inactivation de SENP1 dans les cellules de carcinome hépatocellulaire (HCC) diminue ZEB1 et inhibe l'EMT].

L'hyper-activation d'Akt est essentielle pour l'apparition et la progression des tumeurs, y compris la SG. Dans les cellules d'astrogliome, l'inhibition de SENP1 médiée par l'ARNsi est associée à l'hypophosphorylation d'Akt accompagnée de l'inhibition de ses cibles en aval Bcl-xL et de la régulation à la hausse de cyclinD1 et p21, entraînant un arrêt du cycle cellulaire et une apoptose accrue.

Au total, ces études suggèrent que SENP1 agit comme un hub dont l'inhibition se reflète sur plusieurs cibles dont certaines, c'est-à-dire HIF1α, ZEB1, Akt, sont des facteurs clés de la progression tumorale et des métastases en normoxie comme en hypoxie. Bien que l'effet de SENP1 sur HIF1α dans OS soit connu, il est raisonnable de supposer que SENP1 pourrait médier la régulation à la baisse de ZEB1 et l'inactivation d'Akt également dans OS. Ainsi, de nouvelles stratégies d'inhibition de SENP1 sont des approches thérapeutiques potentiellement efficaces pour bloquer la croissance et les métastases du système d'exploitation.

L'inhibition de SENP1 peut être obtenue par silençage génique médié par les siARN. Cependant, les siARN nus sont très instables et les systèmes de délivrance à base de liposomes sont peu efficaces et cytotoxiques à la fois in vitro et in vivo. Une approche prometteuse pour l'inhibition de l'expression de SENP1 est le silençage génique médié par des acides nucléiques peptidiques (PNA), des oligomères de nucléobases avec le squelette phosphate remplacé par un squelette pseudopeptidique d'unités répétées de N-(2-aminoéthyl) glycine. En raison de leur squelette non naturel, les PNA sont définitivement résistants aux activités nucléase et protéase, forment une liaison plus spécifique et stable avec l'ADN ou l'ARN complémentaire, permettant un effet de silençage efficace et persistant. Bien que la perméabilité des cellules PNA soit très faible, elle peut être efficacement améliorée par leur conjugaison avec des peptides pénétrant dans les cellules (CPP). Au cours des dernières années, les PNA sont apparus comme des outils vraiment prometteurs pour le diagnostic et le traitement du cancer, et, surtout, comme des candidats efficaces pour le silençage génique stable en thérapie génique.

Etude rationnelle et préliminaire :

3 séquences PNA différentes ciblant différentes régions d'ARNm de SENP1 seront conçues et testées. Les PNA seront conjugués à un CPP octa-arginine (R8) qui médie efficacement la délivrance intracellulaire des PNA. L'absorption sera étudiée avec un PNA conjugué à R8 et à la fluorescéine (Fl) à séquence brouillée (scrPNA-R8-Fl).

Une caractérisation in vitro de la capacité du PNA-CPP conçu à pénétrer dans l'intracellulaire et à faire taire la cible SENP1 sera réalisée dans des lignées cellulaires d'OS.

Pour étudier l'absorption de PNA-R8 dans les cellules OS, différentes lignées cellulaires OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) avec un potentiel invasif différent et toutes exprimant SENP1, et des ostéoblastes humains primaires (hOb) comme contrôle négatif pour l'expression de SENP1, vont être utilisé. Après incubation avec scrPNA-R8-Fl à différentes concentrations, l'absorption sera déterminée à des moments consécutifs par cytométrie en flux, tandis que la localisation cytoplasmique sera confirmée par microscopie à fluorescence. Un scrPNA-Fl non conjugué à R8 fonctionnera comme un contrôle négatif, car on ne s'attend pas à ce qu'il pénètre dans la cellule. La cytotoxicité de scrPNA-R8 sera testée par le test Alamar Blue Cell Viability. L'efficacité de silençage des différents conjugués anti-SENP1 PNA-R8 (senpPNA-R8) sera testée dans toutes les lignées cellulaires en normoxie et en hypoxie (1 % O2, 5 % CO2 et 94 % N2). L'efficacité d'inactivation de SENP1 médiée par senpPNA-R8 sera évaluée par RT-qPCR et western-blot (WB). scrPNA-R8 servira de contrôle négatif, tandis que les cellules transfectées avec des siARN ciblant SENP1 serviront de contrôle positif. Dans cette partie, le composé senpPNA-R8 silencieux le plus efficace sera sélectionné.

La régulation à la baisse médiée par senpPNA-R8 de HIF1α, et potentiellement de l'expression de ZEB1 et des inhibitions de la phosphorylation d'Akt, en conséquence de l'inhibition de SENP1 dans les cellules OS, sera analysée par WB. Ainsi, la viabilité cellulaire réduite, la migration et l'invasion, l'induction de l'apoptose et l'inhibition de l'EMT seront dosées et comparées aux effets dans hOb. La viabilité cellulaire sera déterminée par le test Alamar Blue, tandis que l'apoptose sera dosée par cytométrie en flux par coloration à l'annexine V et à l'iodure de propidium. La migration résiduelle et la capacité d'invasion seront évaluées respectivement par un test de cicatrisation et un test d'invasion transwell. La régulation à la baisse de la vimentine et de la N-cadhérine et la régulation à la hausse de la E-cadhérine, des marqueurs EMT et des cibles en aval de ZEB1 (caspase-3, NF-κB) et Akt, (cyclinD1 et Bcl-xL) seront déterminées par WB.

La caractérisation in vitro de la capacité de pénétration et de silence du PNA-CPP conçu dans les lignées cellulaires OS est l'étape préliminaire de l'étude. Une analyse ex vivo de la capacité du PNA-CPP à pénétrer dans un tissu 3D et à faire taire le SENP cible dans un explant de tissu OS de patients suivra.

Objectifs de l'étude :

L'objectif de ce projet est de tester un nouvel inhibiteur puissant de SENP1 à base de PNA, préalablement caractérisé dans un modèle in vitro de lignées cellulaires OS.

Le PNA le plus efficace, conjugué à un CPP perméable aux cellules, capable d'inhiber la viabilité et le caractère invasif des cellules OS dans la normoxie et l'hypoxie grâce à l'inhibition médiée par SENP1 de HIF1α, ZEB1 et Akt, sera étudié pour sa capacité à pénétrer et faire taire l'expression de SENP1 dans les tissus OS humains ex vivo.

Objectif principal :

Déterminer la capacité du PNA-CPP à pénétrer dans un tissu tridimensionnel ex vivo de l'OS, dérivé de matériel biologique perdu obtenu lors de la chirurgie d'éradication de l'OS, et à exercer sa fonction biologique d'inhibition de SENP1 dans le tissu.

Étudier le design:

Pour cette étude, du matériel biologique gaspillé dérivé de la chirurgie d'éradication de l'ostéosarcome sera collecté, qui ne comprend qu'une petite proportion de la masse tumorale retirée autre que celle utilisée pour le diagnostic histologique et moléculaire.

15 patients avec OS primaire seront recrutés. Le groupe cible comprendra les patients hospitalisés à l'IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi qui seront soumis à l'éradication chirurgicale de l'OS primaire.

L'étude sera présentée aux patients âgés de ≥ 18 ans qui peuvent également être recrutés dans le protocole IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (approbation du comité d'éthique n. 29/INT/2017) par le chirurgien. Ces patients signeront deux consentements éclairés : un pour l'étude BioBanca et un pour l'étude PNA-OS.

Les patients âgés de moins de 18 ans seront également recrutés en plus de l'IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca. Ces patients seront considérés comme éligibles à l'étude si le tuteur légal signe les consentements éclairés relatifs à l'étude PNA-OS.

Également des échantillons d'OS déjà existants dans la BioBanca sous forme d'échantillons congelés conservés dans de l'azote liquide chez BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), seront utilisés. Tous les efforts raisonnables seront faits pour appeler ces patients à signer un consentement éclairé spécifique relatif à cette étude.

Étant donné que plusieurs problèmes pratiques (par ex. inadéquation ou faible quantité de matériel biologique) peut survenir, nous envisageons la possibilité de recruter des patients supplémentaires jusqu'à l'obtention de 15 prélèvements complets.

L'étude débutera après l'approbation du comité d'éthique et la durée estimée est de 36 mois, répartis comme suit :

• Délai d'inscription : 24 mois
• Analyse des données : 12 mois

Conception expérimentale:

Analyse ex vivo de la capacité de silençage du PNA-R8 dans des échantillons d'ostéosarcome. Nous étudierons si senpPNA-R8 est capable de pénétrer dans un tissu OS tridimensionnel et d'exercer son effet silencieux.

15 échantillons d'OS seront prélevés soit dans le cadre de l'IRCCS Galeazzi BioBanca (agrément comité d'éthique n° 29/INT/2017) soit auprès de patients nouvellement recrutés, en collaboration avec le C.C.O.O.R.R. équiper.

Seul le matériel biologique gaspillé issu de la chirurgie sera utilisé sans aucun préjudice supplémentaire pour les patients autre que la chirurgie elle-même et l'étude n'implique aucun objectif de diagnostic ou de profilage génétique des échantillons collectés.

Échantillons OS, déjà existants dans la BioBanca sous forme d'échantillons congelés conservés dans de l'azote liquide chez BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), seront utilisés pour déterminer les niveaux d'expression initiaux de SENP1 dans OS par RT-qPCR. Pour cela, les échantillons seront homogénéisés, l'ARN total sera extrait et une RT-qPCR sera effectuée pour tester les niveaux d'expression de SENP1.

Les échantillons restants sur 15, fraîchement prélevés, seront conservés dans une solution physiologique jusqu'à leur utilisation. Les échantillons d'OS seront coupés en morceaux de 3 mm3, placés dans une plaque de culture à 24 puits et cultivés ex vivo sous forme de cultures organotypiques d'OS dans un microenvironnement induit par la normoxie et l'hypoxie sous rotation orbitale [21-23]. Le tissu tumoral organotypique conserve la complexité du tissu d'origine, les cellules tumorales étant entourées de leur microenvironnement d'origine plutôt que de matrices artificielles et ce système est particulièrement avantageux pour le criblage de médicaments ex vivo, pour étudier l'absorption de médicaments et les processus moléculaires. Les cultures OS seront traitées avec senpPNA-R8, et l'expression de SENP1 dans les échantillons naïfs et traités à l'ANP sera déterminée par RT-qPCR et immunohistochimie dans des coupes incluses en paraffine. La capacité du PNA-R8 à pénétrer dans le noyau hypoxique des échantillons d'OS sera évaluée : après incubation avec scrPNA-R8-Fl, les coupes seront immédiatement congelées (-80 °C), traitées et analysées par immunofluorescence.

Les échantillons seront analysés et stockés au Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare de l'Istituto Ortopedico Galeazzi pendant toute la durée de l'étude. À la fin de l'étude, toutes les matières résiduelles seront détruites.