Ингибирование SENP1 для подавления роста OS и метастазирования

Фон:

Остеосаркома (ОС) является наиболее частым типом первичной злокачественной опухоли костей у детей и подростков. Общая выживаемость резко снижается из-за развития метастазов, чаще легочных. В солидных злокачественных опухолях, таких как OS, часто развивается гипоксическое микроокружение, что способствует росту опухоли, метастазированию, неэффективности лечения и смертности пациентов. Адаптация к гипоксии, как и к другим условиям окружающей среды, часто связана с модификациями посттранскрипционной регуляции ключевых эффекторов. Среди них SUMOylation осуществляется небольшими убиквитин-подобными модификаторами (SUMO) белками и динамически реверсируется (deSUMOylation) с помощью Sentrin/SUMO-специфических протеаз (SENP). SENP1, наиболее охарактеризованный SENP, активируется во множественных опухолях, участвуя в онкогенезе и опухолевой прогрессии. Посредством деСУМОилирования SENP1 действует как молекулярный узел, который стабилизирует и активирует ключевые регуляторные факторы, такие как индуцируемый гипоксией фактор 1α (HIF1α), гомеобокс 1, связывающий Е-бокс с цинковыми пальцами (ZEB1), и Akt, отвечающий за адаптацию опухолевых клеток к гипоксии. микроокружение, индукцию клеточной пролиферации, инвазии и миграции, а также ингибирование апоптоза, что способствует прогрессированию опухоли и метастазированию.

HIF1α является основным регулятором транскрипции для клеточной адаптации и выживания в условиях гипоксии и способствует увеличению метастатического потенциала клеток. SENP1-опосредованное деСУМОилирование HIF1α предотвращает деградацию HIF1α протеасомой, тем самым активируя сигнальный путь HIF1α. SENP1 сверхэкспрессируется в OS-клетках в условиях гипоксии, а опосредованное siRNA молчание SENP1 снижает жизнеспособность опухолевых клеток, способствует клеточному апоптозу, снижает инвазивность и ингибирует эпителиально-мезенхимальный переход (EMT).

ZEB1 участвует в онкогенезе, прогрессировании, инвазии и метастазировании в некоторых опухолях (например, глиобластома, предстательная железа, легкие, печень и ободочная кишка). Сайленсинг ZEB1 в OS-клетках приводит к снижению активности каспазы-3, ингибированию NF-kB и iNOS, общему снижению клеточной пролиферации и усилению апоптоза. Нокдаун SENP1 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) снижает ZEB1 и ингибирует EMT].

Гиперактивация Akt необходима для возникновения и прогрессирования опухолей, включая ОС. В клетках астроглиомы опосредованное siRNA ингибирование SENP1 связано с гипофосфорилированием Akt, сопровождающимся ингибированием нижестоящих мишеней Bcl-xL и активацией циклина D1 и p21, что приводит к остановке клеточного цикла и усилению апоптоза.

В целом, эти исследования предполагают, что SENP1 действует как концентратор, ингибирование которого отражается на нескольких мишенях, некоторые из которых, т.е. HIF1α, ZEB1, Akt являются ключевыми факторами опухолевой прогрессии и метастазирования как при нормоксии, так и при гипоксии. Хотя известно влияние SENP1 на HIF1α при ОС, разумно предположить, что SENP1 может опосредовать подавление ZEB1 и инактивацию Akt также при ОС. Таким образом, новые стратегии ингибирования SENP1 являются потенциально эффективными терапевтическими подходами для блокирования роста ОС и метастазирования.

Ингибирование SENP1 может быть достигнуто за счет молчания генов, опосредованного siRNAs. Однако голые siРНК очень нестабильны, а системы доставки на основе липосом малоэффективны и цитотоксичны как in vitro, так и in vivo. Многообещающим подходом к ингибированию экспрессии SENP1 является сайленсинг генов, опосредованный пептидными нуклеиновыми кислотами (ПНК), олигомерами азотистых оснований с заменой фосфатного остова на псевдопептидный остов из повторяющихся звеньев N-(2-аминоэтил)глицина. Из-за своего неестественного остова ПНК окончательно устойчивы как к нуклеазной, так и к протеазной активности, формируют более специфическое и стабильное связывание с комплементарной ДНК или РНК, обеспечивая эффективный и стойкий эффект молчания. Хотя проницаемость клеток ПНК очень низкая, ее можно эффективно повысить путем их конъюгации с проникающими в клетку пептидами (CPP). В последние годы ПНК стали действительно многообещающими инструментами для диагностики и терапии рака и, прежде всего, как эффективные кандидаты для стабильного молчания генов в генной терапии.

Рациональное и предварительное изучение:

Будут разработаны и протестированы 3 разные последовательности ПНК, нацеленные на разные области мРНК SENP1. ПНК будут конъюгированы с октааргининовым (R8) СРР, которые эффективно опосредуют внутриклеточную доставку ПНК. Поглощение будет изучаться с помощью PNA, конъюгированной с R8 и флуоресцеином (Fl) со скремблированной последовательностью (scrPNA-R8-Fl).

In vitro характеристика способности сконструированного PNA-CPP проникать внутрь клеток и подавлять SENP1-мишень будет проводиться в клеточных линиях OS.

Чтобы изучить поглощение PNA-R8 в клетках OS, различные клеточные линии OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) с разным инвазивным потенциалом, все экспрессирующие SENP1, и первичные остеобласты человека (hOb) в качестве отрицательного контроля экспрессии SENP1 будут использоваться. После инкубации с scrPNA-R8-Fl в различных концентрациях поглощение будет определяться в последовательные моменты времени с помощью проточной цитометрии, а цитоплазматическая локализация будет подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии. scrPNA-F1, не конъюгированный с R8, будет функционировать как отрицательный контроль, так как не ожидается, что он попадет в клетку. Цитотоксичность scrPNA-R8 будет оцениваться с помощью анализа жизнеспособности клеток Alamar Blue Cell. Эффективность сайленсинга различных конъюгатов PNA-R8 против SENP1 (senpPNA-R8) будет оцениваться на всех клеточных линиях как при нормоксии, так и при гипоксии (1% O2, 5% CO2 и 94% N2). Эффективность подавления SENP1, опосредованная senpPNA-R8, будет оцениваться с помощью RT-qPCR и вестерн-блоттинга (WB). scrPNA-R8 будет служить отрицательным контролем, а клетки, трансфицированные миРНК, нацеленной на SENP1, будут служить положительным контролем. В этой части будет выбрано наиболее эффективное соединение senpPNA-R8, обеспечивающее сайленсинг.

Опосредованное senpPNA-R8 подавление HIF1α и, возможно, экспрессии ZEB1 и ингибирования фосфорилирования Akt как следствие ингибирования SENP1 в клетках OS будет проанализировано с помощью WB. Таким образом, сниженная жизнеспособность клеток, миграция и инвазия, индукция апоптоза и ингибирование ЭМП будут оцениваться и сравниваться с эффектами в hOb. Жизнеспособность клеток определяют с помощью анализа с аламаровым синим, тогда как апоптоз определяют с помощью проточной цитометрии путем окрашивания аннексином V и йодидом пропидия. Остаточная миграция и способность к инвазии будут оцениваться с помощью анализа заживления ран и анализа инвазии трансвелла соответственно. Понижающая регуляция виментина и N-кадгерина и повышающая регуляция E-кадгерина, маркеров EMT и нижестоящих мишеней ZEB1 (каспаза-3, NF-kB) и Akt (циклинD1 и Bcl-xL) будут определяться WB.

Предварительным этапом исследования является характеристика in vitro способности сконструированного PNA-CPP к подавлению и подавлению активности в клеточных линиях OS. Последует анализ ex vivo способности PNA-CPP проникать в трехмерную ткань и подавлять целевые SENP в тканевых эксплантатах OS пациентов.

Цели исследования:

Целью этого проекта является тестирование нового мощного ингибитора SENP1 на основе ПНК, ранее охарактеризованного в модели клеточных линий OS in vitro.

Наиболее эффективная PNA, конъюгированная с проникающим в клетки CPP, которая способна ингибировать жизнеспособность и инвазивность OS-клеток как при нормоксии, так и при гипоксии посредством SENP1-опосредованного ингибирования HIF1α, ZEB1 и Akt, будет исследована на предмет ее способности проникать и молчание экспрессии SENP1 в тканях ОС человека ex vivo.

Основная цель:

Определить способность PNA-CPP проникать в трехмерную ткань OS ex vivo, полученную из отработанного биологического материала, полученного во время операции по эрадикации OS, и выполнять свою биологическую функцию ингибирования SENP1 в ткани.

Дизайн исследования:

Для этого исследования будет собран отработанный биологический материал, полученный в результате операции по ликвидации остеосаркомы, который составляет лишь небольшую часть удаленной опухолевой массы, кроме той, которая используется для гистологической и молекулярной диагностики.

Будут набраны 15 пациентов с первичной ОС. Целевая группа будет состоять из пациентов, госпитализированных в IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, которым будет проведена хирургическая эрадикация первичной ОС.

Исследование будет представлено пациентам в возрасте ≥18 лет, которые также могут быть включены хирургом в протокол IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (одобрение комитета по этике № 29/INT/2017). Эти пациенты подпишут два информированных согласия: одно для BioBanca и одно для исследования PNA-OS.

Помимо IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca, будут дополнительно набраны пациенты в возрасте до 18 лет. Эти пациенты будут считаться подходящими для участия в исследовании, если юрисконсульт подпишет информированное согласие в отношении исследования PNA-OS.

Также образцы ОС, уже существующие в BioBanca, в виде замороженных образцов, хранящихся в жидком азоте у поставщика услуг BioRep (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Милан). Будут предприняты все разумные усилия, чтобы призвать этих пациентов подписать конкретное информированное согласие в отношении этого исследования.

Поскольку несколько практических вопросов (например, может произойти непригодность или малое количество биологического материала), мы предусматриваем возможность набора дополнительных пациентов до достижения 15 полных образцов.

Исследование начнется после утверждения Комитетом по этике, и его предполагаемая продолжительность составит 36 месяцев, разделенных следующим образом:

• Срок регистрации: 24 месяца
• Анализ данных: 12 месяцев

Экспериментальная дизайн:

Анализ ex vivo способности PNA-R8 подавлять активность в образцах остеосаркомы. Мы исследуем, способна ли senpPNA-R8 проникать в трехмерную ткань ОС и оказывать эффект подавления.

15 образцов ОС будут взяты либо в контексте IRCCS Galeazzi BioBanca (одобрение комитета по этике № 29/INT/2017), либо у вновь набранных пациентов в сотрудничестве с C.C.O.O.R.R. оборудовать.

Только отработанный биологический материал, полученный в результате операции, будет использоваться без какого-либо дополнительного вреда для пациентов, кроме самой операции, и исследование не включает в себя какие-либо диагностические цели или генетическое профилирование собранных образцов.

Образцы OS, уже существующие в BioBanca в виде замороженных образцов, хранящихся в жидком азоте у поставщика услуг BioRep (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), будет использоваться для определения начальных уровней экспрессии SENP1 в OS с помощью RT-qPCR. Для этого образцы будут гомогенизированы, будет извлечена общая РНК, и будет проведена RT-qPCR для определения уровней экспрессии SENP1.

Остальные образцы из 15 свежесобранных будут храниться в физиологическом растворе до использования. Образцы ОС будут нарезаны на кусочки объемом 3 мм3, помещены в 24-луночный культуральный планшет и культивированы ex vivo как органотипические культуры ОС как в нормокси-, так и в индуцированной гипоксией микросреде при орбитальном вращении [21-23]. Органотипическая опухолевая ткань сохраняет сложность исходной ткани с опухолевыми клетками, окруженными их исходной микросредой, а не искусственными матрицами, и эта система особенно полезна для скрининга лекарств ex vivo, для изучения поглощения лекарств и молекулярных процессов. Культуры OS будут обработаны senpPNA-R8, а экспрессия SENP1 в наивных и обработанных PNA образцах будет определяться с помощью RT-qPCR и иммуногистохимии в срезах, залитых парафином. Будет оцениваться способность PNA-R8 проникать в гипоксическое ядро ​​образцов OS: после инкубации с scrPNA-R8-Fl срезы будут немедленно заморожены (-80°C), обработаны и проанализированы методом иммунофлуоресценции.

Образцы будут проанализированы и храниться в Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare Istituto Ortopedico Galeazzi в течение всего периода исследования. По окончании исследования весь остаточный материал будет уничтожен.