Hamowanie SENP1 w celu zahamowania wzrostu OS i przerzutów

Tło:

Kostniakomięsak (OS) jest najczęstszym rodzajem pierwotnego nowotworu złośliwego kości u dzieci i młodzieży. Ogólny wskaźnik przeżycia jest dramatycznie zmniejszony przez rozwój przerzutów, często płucnych. Złośliwe guzy lite, takie jak OS, często rozwijają niedotlenione mikrośrodowisko, które przyczynia się do wzrostu guza, przerzutów, niepowodzeń leczenia i śmiertelności pacjentów. Adaptacja do niedotlenienia, jak również do innych warunków środowiskowych, często wiąże się z modyfikacjami potranskrypcyjnej regulacji kluczowych efektorów. Wśród nich SUMOilacja jest przeprowadzana przez małe białka modyfikujące podobne do ubikwityny (SUMO) i jest dynamicznie odwracana (deSUMOilacja) przez proteazy specyficzne dla Sentrin / SUMO (SENP). SENP1, najlepiej scharakteryzowany SENP, jest regulowany w górę w wielu nowotworach biorących udział w nowotworzeniu i progresji nowotworu. Poprzez deSUMOilację, SENP1 działa jako centrum molekularne, które stabilizuje i aktywuje kluczowe czynniki regulacyjne, takie jak czynnik indukowany niedotlenieniem 1α (HIF1α), homeobox 1 wiążący E-box z palcem cynkowym (ZEB1) i Akt, odpowiedzialny za adaptację komórek nowotworowych do niedotlenienia mikrośrodowiska, indukcję proliferacji, inwazji i migracji komórek oraz hamowanie apoptozy, przyczyniając się w ten sposób do progresji nowotworu i przerzutów.

HIF1α jest głównym regulatorem transkrypcji dla adaptacji komórkowej i przeżycia w warunkach niedotlenienia i przyczynia się do zwiększenia potencjału przerzutowego komórek. DeSUMOilacja HIF1α za pośrednictwem SENP1 zapobiega degradacji HIF1α przez proteasom, aktywując w ten sposób szlak sygnałowy HIF1α. SENP1 ulega nadekspresji w komórkach OS w warunkach niedotlenienia, a wyciszanie SENP1 za pośrednictwem siRNA zmniejsza żywotność komórek nowotworowych, sprzyja apoptozie komórek, zmniejsza inwazyjność i hamuje przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT).

ZEB1 bierze udział w nowotworzeniu, progresji, inwazji i przerzutach w kilku nowotworach (np. glejak, prostata, płuca, wątroba i jelito grube). Wyciszanie ZEB1 w komórkach OS prowadzi do zmniejszonej aktywności kaspazy-3, hamowania NF-κB i iNOS, ogólnego zmniejszenia proliferacji komórek i zwiększonej apoptozy. Knockdown SENP1 w komórkach raka wątrobowokomórkowego (HCC) zmniejsza ZEB1 i hamuje EMT].

Hiperaktywacja Akt jest niezbędna do wystąpienia i progresji nowotworów, w tym OS. W komórkach gwiaździaka hamowanie SENP1 za pośrednictwem siRNA jest związane z hipofosforylacją Akt, której towarzyszy hamowanie jego dalszych celów Bcl-xL oraz regulacja w górę cykliny D1 i p21, co prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego i zwiększonej apoptozy.

W sumie badania te sugerują, że SENP1 działa jako centrum, którego hamowanie odzwierciedla wiele celów, z których niektóre, tj. HIF1α, ZEB1, Akt są kluczowymi czynnikami w progresji guza i przerzutach zarówno w normoksji, jak i niedotlenieniu. Chociaż znany jest wpływ SENP1 na HIF1α w OS, uzasadnione jest założenie, że SENP1 może pośredniczyć w obniżeniu poziomu ZEB1 i inaktywacji Akt również w OS. Zatem nowe strategie hamowania SENP1 są potencjalnie skutecznymi podejściami terapeutycznymi do blokowania wzrostu OS i przerzutów.

Hamowanie SENP1 można osiągnąć poprzez wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA. Jednak nagie siRNA są wysoce niestabilne, a systemy dostarczania oparte na liposomach są słabo wydajne i cytotoksyczne zarówno in vitro, jak i in vivo. Obiecującym podejściem do hamowania ekspresji SENP1 jest wyciszanie genów za pośrednictwem peptydowych kwasów nukleinowych (PNA), oligomerów zasad nukleinowych, w których szkielet fosforanowy zastąpiono szkieletem pseudopeptydowym składającym się z powtarzających się jednostek N-(2-aminoetylo)glicyny. Ze względu na swój nienaturalny szkielet, PNA są definitywnie odporne zarówno na aktywność nukleazy, jak i proteazy, tworzą bardziej specyficzne i stabilne wiązanie z komplementarnym DNA lub RNA, umożliwiając skuteczny i trwały efekt wyciszania. Chociaż przepuszczalność komórek PNA jest bardzo słaba, można ją skutecznie zwiększyć poprzez ich sprzęganie z peptydami przenikającymi do komórki (CPP). W ostatnich latach PNA stały się naprawdę obiecującymi narzędziami do diagnostyki i terapii nowotworów, a przede wszystkim skutecznymi kandydatami do stabilnego wyciszania genów w terapii genowej.

Racjonalne i wstępne badanie:

Zaprojektowane i przetestowane zostaną 3 różne sekwencje PNA ukierunkowane na różne regiony mRNA SENP1. PNA będą sprzężone z CPP okta-argininy (R8), który skutecznie pośredniczy w dostarczaniu PNA do wewnątrz komórki. Wychwyt będzie badany za pomocą PNA skoniugowanego z R8 i fluoresceiną (Fl) o wymieszanej sekwencji (scrPNA-R8-Fl).

Charakterystyka in vitro zdolności zaprojektowanego PNA-CPP do penetracji wewnątrzkomórkowej i wyciszenia docelowego SENP1 zostanie przeprowadzona w liniach komórkowych OS.

Aby zbadać wychwyt PNA-R8 w komórkach OS, różne linie komórkowe OS (SaOS-2, MG-63, U2OS) o różnym potencjale inwazyjnym i wszystkie wyrażające SENP1 oraz pierwotne ludzkie osteoblasty (hOb) jako kontrola negatywna dla ekspresji SENP1, będą być użytym. Po inkubacji z scrPNA-R8-F1 w różnych stężeniach wychwyt zostanie określony w kolejnych punktach czasowych za pomocą cytometrii przepływowej, podczas gdy lokalizacja w cytoplazmie zostanie potwierdzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. ScPNA-Fl nie skoniugowany z R8 będzie działał jako kontrola negatywna, ponieważ nie oczekuje się, że wejdzie do komórki. Cytotoksyczność scrPNA-R8 będzie badana w teście Alamar Blue Cell Viability. Skuteczność wyciszania różnych koniugatów anty-SENP1 PNA-R8 (senpPNA-R8) będzie badana we wszystkich liniach komórkowych zarówno w normoksji, jak i hipoksji (1% O2, 5% CO2 i 94% N2). Skuteczność wyciszania SENP1 za pośrednictwem senpPNA-R8 zostanie oceniona za pomocą RT-qPCR i western-blot (WB). scrPNA-R8 będzie służyć jako kontrola negatywna, podczas gdy komórki transfekowane siRNA ukierunkowanym na SENP1 będą służyć jako kontrola pozytywna. W tej części wybrany zostanie najskuteczniejszy wyciszający związek senpPNA-R8.

Regulacja w dół HIF1α za pośrednictwem senpPNA-R8 i potencjalnie zahamowanie ekspresji ZEB1 i fosforylacji Akt, jako konsekwencja hamowania SENP1 w komórkach OS, będzie badane za pomocą WB. Zatem zmniejszona żywotność komórek, migracja i inwazja, indukcja apoptozy i hamowanie EMT będą badane i porównywane z efektami w hOb. Żywotność komórek zostanie określona za pomocą testu Alamar Blue, podczas gdy apoptoza zostanie zbadana za pomocą cytometrii przepływowej przez barwienie aneksyną V i jodkiem propidyny. Resztkowa migracja i zdolność do inwazji zostaną ocenione, odpowiednio, za pomocą testu gojenia się ran i testu inwazji przez studzienkę. Regulacja w dół wimentyny i N-kadheryny oraz regulacja w górę E-kadheryny, markerów EMT i dalszych celów ZEB1 (kaspaza-3, NF-κB) i Akt, (cyklinaD1 i Bcl-xL) zostaną określone przez WB.

Charakterystyka in vitro zdolności penetracji i wyciszania zaprojektowanego PNA-CPP w liniach komórkowych OS jest wstępnym etapem badań. Nastąpi analiza ex vivo zdolności PNA-CPP do penetracji tkanki 3D i wyciszenia docelowego SENP w eksplantacie tkanki OS od pacjentów.

Cele badania:

Celem tego projektu jest przetestowanie nowego silnego inhibitora SENP1 na bazie PNA, wcześniej scharakteryzowanego w modelu in vitro linii komórkowych OS.

Najskuteczniejszy PNA, skoniugowany z przepuszczalnym dla komórek CPP, który jest zdolny do hamowania żywotności i inwazyjności komórek OS zarówno w normoksji, jak i niedotlenieniu poprzez hamowanie HIF1α, ZEB1 i Akt za pośrednictwem SENP1, zostanie zbadany pod kątem jego zdolności do penetracji i wyciszyć ekspresję SENP1 w ludzkich tkankach OS ex vivo.

Główny cel:

Określenie zdolności PNA-CPP do penetracji trójwymiarowej tkanki OS ex vivo, pochodzącej z zmarnowanego materiału biologicznego uzyskanego podczas operacji eradykacji OS, oraz do wywierania biologicznej funkcji hamowania SENP1 w tkance.

Projekt badania:

Do tego badania zostanie zebrany zmarnowany materiał biologiczny pochodzący z chirurgii eradykacji kostniakomięsaka, który stanowi jedynie niewielką część usuniętej masy guza innej niż ta wykorzystywana do diagnostyki histologicznej i molekularnej.

Zrekrutowanych zostanie 15 pacjentów z pierwotnym OS. Grupą docelową będą pacjenci hospitalizowani w IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, którzy zostaną poddani chirurgicznemu wyeliminowaniu pierwotnego OS.

Do badania zostaną zaprezentowani pacjenci w wieku ≥18 lat, których chirurg może zrekrutować również w protokole IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca (zgoda komisji etycznej nr 29/INT/2017). Pacjenci ci podpiszą dwie świadome zgody: jedną dla badania BioBanca i jedną dla badania PNA-OS.

Oprócz IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca rekrutowani będą dodatkowo pacjenci w wieku <18 lat. Ci pacjenci zostaną uznani za kwalifikujących się do badania, jeśli opiekun prawny podpisze świadomą zgodę dotyczącą badania PNA-OS.

Również próbki OS już istniejące w BioBanca jako zamrożone próbki zakonserwowane w ciekłym azocie u BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Mediolan). Dołożymy wszelkich starań, aby wezwać tych pacjentów do podpisania określonej świadomej zgody na to badanie.

Ponieważ kilka kwestii praktycznych (m.in. może wystąpić nieprzydatność lub mała ilość materiału biologicznego), przewidujemy możliwość rekrutacji dodatkowych pacjentów do czasu uzyskania 15 kompletnych próbek.

Badanie rozpocznie się po zatwierdzeniu przez Komisję Etyczną, a szacowany czas trwania to 36 miesięcy, z podziałem na:

• Czas rejestracji: 24 miesiące
• Analiza danych: 12 miesięcy

Eksperymentalny projekt:

Analiza ex vivo zdolności wyciszania PNA-R8 w próbkach kostniakomięsaka. Zbadamy, czy senpPNA-R8 jest w stanie przeniknąć do trójwymiarowej tkanki OS i wywierać efekt wyciszający.

15 próbek OS zostanie pobranych w ramach IRCCS Galeazzi BioBanca (zgoda komisji etycznej nr 29/INT/2017) lub od nowo zrekrutowanych pacjentów we współpracy z C.C.O.O.R.R. wyposażyć.

Tylko zmarnowany materiał biologiczny pochodzący z operacji zostanie wykorzystany bez dodatkowej szkody dla pacjentów poza samą operacją, a badanie nie obejmuje żadnego celu diagnostycznego ani profilowania genetycznego pobranych próbek.

Próbki OS, istniejące już w BioBanca jako zamrożone próbki zakonserwowane w ciekłym azocie u BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), zostaną użyte do określenia początkowych poziomów ekspresji SENP1 w OS za pomocą RT-qPCR. W tym celu próbki zostaną zhomogenizowane, całkowity RNA zostanie wyekstrahowany, a RT-qPCR zostanie przeprowadzony pod kątem poziomów ekspresji SENP1.

Pozostałe z 15 świeżo pobranych próbek będą przechowywane w roztworze fizjologicznym do czasu użycia. Próbki OS zostaną pocięte na kawałki o objętości 3 mm3, umieszczone w 24-dołkowej płytce hodowlanej i hodowane ex vivo jako organotypowe hodowle OS w mikrośrodowisku zarówno normoksji, jak i wywołanym niedotlenieniem w rotacji orbitalnej [21-23]. Organotypowa tkanka nowotworowa zachowuje złożoność oryginalnej tkanki, a komórki nowotworowe są otoczone ich pierwotnym mikrośrodowiskiem, a nie sztucznymi macierzami, a ten system jest szczególnie korzystny do badań przesiewowych leków ex vivo, do badania wychwytu leków i procesów molekularnych. Hodowle OS będą traktowane senpPNA-R8, a ekspresja SENP1 w próbkach naiwnych i traktowanych PNA zostanie określona za pomocą RT-qPCR i immunohistochemii w skrawkach zatopionych w parafinie. Zdolność PNA-R8 do penetracji niedotlenionego rdzenia próbek OS zostanie oceniona: po inkubacji ze scrPNA-R8-F1 skrawki zostaną natychmiast zamrożone (-80°C), przetworzone i zanalizowane metodą immunofluorescencyjną.

Próbki będą analizowane i przechowywane w Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare w Istituto Ortopedico Galeazzi przez cały czas trwania badania. Pod koniec badania każdy pozostały materiał zostanie zniszczony.