Hemming av SENP1 for undertrykkelse av OS-vekst og metastase

Bakgrunn:

Osteosarkom (OS) er den vanligste typen primær ondartet beinsvulst hos barn og ungdom. Den totale overlevelsesraten reduseres dramatisk ved utvikling av metastaser, ofte lunge. Solide ondartede svulster, som OS, utvikler ofte et hypoksisk mikromiljø, som bidrar til tumorvekst, metastaser, behandlingssvikt og pasientdødelighet. Tilpasning til hypoksi, så vel som til andre miljøforhold, er ofte assosiert med modifikasjoner i post-transkripsjonell regulering av nøkkeleffektorer. Blant disse utføres SUMOylering av små ubiquitin-like modifier (SUMO) proteiner og reverseres dynamisk (deSUMOylation) av Sentrin/SUMO-spesifikke proteaser (SENPs). SENP1, den best karakteriserte SENP, er oppregulert i flere svulster som er involvert i tumorgenese og tumorprogresjon. Gjennom deSUMOylering fungerer SENP1 som et molekylært nav som stabiliserer og aktiverer viktige regulatorfaktorer, slik som hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF1α), sinkfinger E-boks bindende homeobox 1 (ZEB1), og Akt, ansvarlig for tumorcellers tilpasning til hypoksisk mikromiljø, induksjon av celleproliferasjon, invasjon og migrasjon, og hemming av apoptose, og dermed bidra til tumorprogresjon og metastasering.

HIF1α er hovedtranskripsjonsregulatoren for cellulær tilpasning og overlevelse under hypoksiske forhold, og bidrar til å øke cellemetastaseringspotensialet. SENP1-mediert HIF1α-deSUMOylering forhindrer HIF1α-nedbrytning av proteasom, og aktiverer dermed HIF1α-signalveien. SENP1 er overuttrykt i OS-celler under hypoksisk tilstand og siRNA-mediert demping av SENP1 reduserer tumorcellelevedyktighet, fremmer celleapoptose, reduserer invasivitet og hemmer epitel-mesenkymal overgang (EMT).

ZEB1 er involvert i tumorgenese, progresjon, invasjon og metastaser i flere svulster (f. glioblastom, prostata, lunge, lever og kolorektal). ZEB1-demping i OS-celler fører til redusert caspase-3-aktivitet, NF-KB og iNOS-hemming, generell redusert celleproliferasjon og økt apoptose. SENP1 knockdown i hepatocellulært karsinom (HCC) celler reduserer ZEB1 og hemmer EMT].

Akt hyperaktivering er avgjørende for utbruddet og progresjonen av svulster, inkludert OS. I astrogliomceller er siRNA-mediert hemming av SENP1 assosiert med Akt hypofosforylering ledsaget av hemming av dets nedstrømsmål Bcl-xL og cyclinD1 og p21 oppregulering, noe som fører til cellesyklusstans og økt apoptose.

Til sammen antyder disse studiene at SENP1 fungerer som et knutepunkt hvis hemming reflekterer på flere mål, hvorav noen, dvs. HIF1α, ZEB1, Akt, er nøkkelfaktorer i tumorprogresjon og metastase ved både normoksi og hypoksi. Selv om det er kjent effekten av SENP1 på HIF1α i OS, er det rimelig å anta at SENP1 kan formidle ZEB1-nedregulering og Akt-inaktivering også i OS. Dermed er nye SENP1-hemmingsstrategier potensielt effektive terapeutiske tilnærminger for å blokkere OS-vekst og metastase.

SENP1-hemming kan oppnås ved gendemping mediert av siRNA-er. Imidlertid er nakne siRNA-er svært ustabile og liposombaserte leveringssystemer er lite effektive og cytotoksiske både in vitro og in vivo. En lovende tilnærming for inhibering av SENP1-ekspresjon er gendemping mediert av peptidnukleinsyrer (PNA), nukleobaseoligomerer med fosfatryggraden erstattet av en pseudopeptidryggrad av gjentatte enheter av N-(2-aminoetyl)glysin. På grunn av deres unaturlige ryggrad er PNA-er definitivt motstandsdyktige mot både nuklease- og proteaseaktiviteter, danner en mer spesifikk og stabil binding med det komplementære DNA eller RNA, noe som tillater en effektiv og vedvarende dempende effekt. Selv om PNA-cellepermeabiliteten er svært dårlig, kan den effektivt forbedres ved deres konjugering med cellepenetrerende peptider (CPP). De siste årene har PNA dukket opp som virkelig lovende verktøy for kreftdiagnostikk og terapi, og fremfor alt som effektive kandidater for stabil gendemping i genterapi.

Rasjonell og forstudie:

3 forskjellige PNA-sekvenser rettet mot forskjellige SENP1 mRNA-regioner vil bli designet og testet. PNA-er vil bli konjugert til en okta-arginin (R8) CPP som effektivt medierer den intracellulære leveringen av PNA-er. Opptaket vil bli studert med en scrambled-sekvens R8- og fluorescein (Fl)-konjugert PNA (scrPNA-R8-Fl).

En in vitro karakterisering av evnen til den designet PNA-CPP til å penetrere intracellulært og å dempe målet SENP1 vil bli utført i cellelinjer av OS.

For å studere PNA-R8-opptaket i OS-celler, vil forskjellige OS-cellelinjer (SaOS-2, MG-63, U2OS) med forskjellig invasivt potensial og som alle uttrykker SENP1, og primære humane osteoblaster (hOb) som negativ kontroll for SENP1-ekspresjon, bli brukt. Etter inkubasjon med scrPNA-R8-Fl ved forskjellige konsentrasjoner vil opptaket bli bestemt ved påfølgende tidspunkt ved flowcytometri, mens den cytoplasmatiske lokaliseringen vil bli bekreftet ved fluorescensmikroskopi. En scrPNA-Fl som ikke er konjugert til R8 vil fungere som en negativ kontroll, da den ikke forventes å gå inn i cellen. Cytotoksisitet av scrPNA-R8 vil bli analysert med Alamar Blue Cell Viability-analyse. Dempingseffektiviteten til de forskjellige anti-SENP1 PNA-R8-konjugatene (senpPNA-R8) vil bli analysert i alle cellelinjer i både normoksi og hypoksi (1 % O2, 5 % CO2 og 94 % N2). SenpPNA-R8-mediert SENP1-dempningseffektivitet vil bli vurdert ved RT-qPCR og western-blot (WB). scrPNA-R8 vil tjene som negativ kontroll, mens celler transfektert med siRNA rettet mot SENP1 vil tjene som positiv kontroll. I denne delen vil den mest effektive senpPNA-R8-forbindelsen bli valgt.

SenpPNA-R8-mediert nedregulering av HIF1α, og potensielt av ZEB1-ekspresjon og Akt-fosforyleringshemminger, som følge av SENP1-hemming i OS-celler, vil bli analysert av WB. Dermed vil redusert cellelevedyktighet, migrasjon og invasjon, induksjon av apoptose og EMT-hemming bli analysert, og sammenlignet med effektene i hOb. Cellelevedyktighet vil bli bestemt ved Alamar Blue-analyse, mens apoptose vil bli analysert ved flowcytometri ved farging av Annexin V og med propidiumjodid. Den gjenværende migrasjons- og invasjonsevnen vil bli vurdert ved henholdsvis sårhelingsanalyse og transwell invasjonsanalyse. Nedregulering av vimentin og N-cadherin og oppregulering av E-cadherin, EMT-markører og av nedstrømsmålene til ZEB1 (caspase-3, NF-κB) og Akt, (cyclinD1 og Bcl-xL) vil bli bestemt av WB.

In vitro-karakteriseringen av penetrasjons- og lyddempingsevnen til den designet PNA-CPP i OS-cellelinjer er det foreløpige trinnet i studien. En ex vivo-analyse av evnen til PNA-CPP til å trenge inn i et 3D-vev og dempe målet SENP i en OS-vevsekplantat fra pasienter vil følge.

Mål med studien:

Målet med dette prosjektet er å teste en ny kraftig PNA-basert SENP1-hemmer, tidligere karakterisert i en in vitro-modell av OS-cellelinjer.

Den mest effektive PNA, konjugert med en cellepermeabel CPP, som er i stand til å hemme OS-cellers levedyktighet og invasivitet i både normoksi og hypoksi gjennom SENP1-mediert hemming av HIF1α, ZEB1 og Akt, vil bli undersøkt for sin evne til å penetrere og stille SENP1-uttrykk i ex vivo humant OS-vev.

Primært mål:

For å bestemme evnen til PNA-CPP til å trenge inn i et ex vivo tredimensjonalt vev av OS, avledet fra bortkastet biologisk materiale oppnådd under OS-utryddelseskirurgi, og å utøve sin biologiske funksjon med å hemme SENP1 i vevet.

Studere design:

For denne studien vil det samles inn bortkastet biologisk materiale som stammer fra osteosarkom-utryddelseskirurgi som utgjør kun en liten andel av den fjernede tumormassen annet enn det som brukes til histologisk og molekylær diagnose.

15 pasienter med primær OS skal rekrutteres. Målgruppen vil omfatte pasienter innlagt på sykehus ved IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi som vil bli utsatt for kirurgisk utryddelse av primær OS.

Studien vil bli presentert for pasienter med alder ≥18 år som også kan rekrutteres i IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca-protokollen (godkjenning av etisk komité nr. 29/INT/2017) av kirurgen. Disse pasientene vil signere to informerte samtykker: ett for BioBanca og ett for PNA-OS-studien.

Pasienter med alder <18 år vil bli rekruttert i tillegg i tillegg til IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi BioBanca. Disse pasientene vil bli vurdert som kvalifisert for studien hvis den juridiske veilederen vil signere de informerte samtykkene i forhold til PNA-OS-studien.

Også prøver av OS som allerede eksisterer i BioBanca som frosne prøver konservert i flytende nitrogen hos BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), vil bli brukt. Alle rimelige anstrengelser vil bli gjort for å kalle disse pasientene for å signere et spesifikt informert samtykke i forhold til denne studien.

Siden flere praktiske problemer (f.eks. uegnethet eller lav mengde biologisk materiale) kan forekomme, ser vi for oss muligheten for å rekruttere ytterligere pasienter inntil 15 komplette prøver er oppnådd.

Studien vil starte etter godkjenning av den etiske komité og den estimerte varigheten er 36 måneder, fordelt på følgende:

• Tidspunkt for påmelding: 24 måneder
• Dataanalyse: 12 måneder

Eksperimentelt design:

Ex vivo-analyse av PNA-R8-dempende evne i osteosarkomprøver. Vi vil undersøke om senpPNA-R8 er i stand til å trenge inn i et tredimensjonalt OS-vev og utøve sin dempende effekt.

15 OS-prøver vil bli samlet inn enten i sammenheng med IRCCS Galeazzi BioBanca (etisk komitégodkjenning n. 29/INT/2017) eller fra nyrekrutterte pasienter, i samarbeid med C.C.O.O.R.R. utruste.

Kun bortkastet biologisk materiale fra kirurgi vil bli brukt uten ytterligere skade på pasientene enn selve operasjonen, og studien involverer ikke noe diagnostisk mål eller genetisk profilering av prøvene som samles inn.

OS-prøver, som allerede eksisterer i BioBanca som frosne prøver konservert i flytende nitrogen hos BioRep Service-Provider (BioRep S.r.l. Via Olgettina 60, 20132, Milano), vil bli brukt til å bestemme de innledende ekspresjonsnivåene til SENP1 i OS ved RT-qPCR. For dette vil prøver homogeniseres, totalt RNA vil bli ekstrahert og RT-qPCR vil bli utført for å analysere SENP1-ekspresjonsnivåer.

De gjenværende prøvene av 15, nysamlet, vil bli bevart i fysiologisk løsning frem til bruk. OS-prøvene vil bli kuttet i 3 mm3 stykker, plassert i en 24-multibrønns kulturplate, og dyrket ex vivo som organotypiske OS-kulturer i både normoksi og hypoksi-indusert mikromiljø under orbital rotasjon [21-23]. Organotypisk tumorvev opprettholder kompleksiteten til det opprinnelige vevet med tumorceller som er omgitt av deres opprinnelige mikromiljø i stedet for kunstige matriser, og dette systemet er spesielt fordelaktig for ex vivo medikamentscreening, for å studere medikamentopptak og molekylære prosesser. OS-kulturer vil bli behandlet med senpPNA-R8, og SENP1-ekspresjon i naive og PNA-behandlede prøver vil bli bestemt ved RT-qPCR og immunhistokjemi i parafininnstøpte seksjoner. Evnen til PNA-R8 til å trenge inn i den hypoksiske kjernen til OS-prøvene vil bli vurdert: etter inkubering med scrPNA-R8-Fl vil seksjoner umiddelbart fryses (-80°C), behandles og analyseres ved immunfluorescens.

Prøver vil bli analysert og lagret ved Laboratorio di Biochimica Sperimentale e Biologia Molecolare ved Istituto Ortopedico Galeazzi under hele studiens varighet. På slutten av studien vil alle gjenværende materiale bli ødelagt.