AMLへのMIFの関与 (MIFAML)

この研究は、成人AMLにおけるMIFの関与を研究することを目的としています。

1. 調査中の要素の説明 1.1. MIF 濃度の測定 患者およびコントロールからの血漿および BM 上清 (血液および BM 血漿の年齢をマッチさせた 100 人のコントロール、Tours Hospital、ClinicalTrials.gov で入手可能) #NCT02789839 ) を ELISA で分析します。 BM 上清は、2 段階の遠心分離手順の後に得られます: AML 患者またはコントロール BM からの新鮮な BM 1 mL を 540 g で 5 分間遠心分離して、ペレット内の生存細胞を回収します (サイトメトリーおよび発現研究用)。上清を1000g/15分/4℃で遠心分離して血漿を調製する。 BM と血漿中の MIF 濃度を体系的に比較します。 MIF 濃度は、炎症、白血球増加症、単球増加症などのさまざまな要因の影響を受ける可能性があるため、血球数と血漿 C 反応性タンパク質レベルが測定され、データの解釈に考慮されます。

1.2. MIF、CD74、および CXCR4 発現の測定病気。 コントロールBMサンプルからの造血幹細胞および前駆細胞も同様にソートされます。 MIF、CD74、および CXCR4 RNA 発現は、選別された細胞亜集団における定量的 RT-PCR によって研究されます。 CXCR4 および抗 CD74、ならびに細胞内 CD74 の表面発現は、サイトメトリーを使用したマルチパラメトリック フローによって研究されます。

1.3。 完全寛解時の MIF、CD74、CXCR4 発現、および MIF 濃度の分析。

a) および b) で実行される分析は、30 ～ 50 人の選択された患者の完全寛解サンプルで繰り返されます。 患者は、治療に対する反応（完全寛解と正常な血球数の評価）、および疾患の遺伝子型（診断時に TET2 または DNMT3A 変異を有する 15 ～ 25 人の患者と、これらの変異を持たない 15 ～ 25 人の患者）に従って選択されます。 . サンプルは、寛解評価時に2回の化学療法コース後に収集されます。 可能な限り、長期寛解（診断後1年以上）の患者の骨髄対照を収集し、研究する。 その間、NGS、ddPCR、FISH、または RT-PCR 技術を使用して、最初の AML 病変の持続性または欠如を評価します。

含まれる患者の 80% について完全な材料が得られると予想され、240 人の患者という目標を 3 年以内に達成することができます。 細胞精製は、異常な免疫表現型を伴う AML との関連で問題になる可能性があります。これは、適切な FACS プロトコルの使用によって考慮されます。 MIF 経路への注目に関しては、他のケモカイン/サイトカイン、または他の分子が AML 細胞とその微小環境の伝達に関与している可能性を排除することはできません。 したがって、BM と血漿のアリコートは凍結保存され、戦略を改良することができます (たとえば、サン アントワーヌ病院で利用可能なサイトカイン アレイ、ELISA、または MS 分析を実行するため)。

1.4。 NSG マウスにおける初代 AML の異種移植モデル 初代 AML 細胞の異種移植モデルは、MIF 発現、細胞遺伝学的および分子遺伝子型が分析される 70 の AML のコホートで開発され、これらのパラメーターを異なる生着表現型に関連付けます。

1.5。 AML 細胞を移植した NSG マウス、および TET2 枯渇または DNMT3A 枯渇臍帯血 HSPC を移植した NSG マウスにおける MIF 阻害 初代細胞を異種移植した NSG マウスにおける白血病発症に対する MIF の役割にアクセスします。 これらの実験では、生着したコホートの TET2 変異を持つ 6 人の患者からの一次 AML 患者細胞を使用して、白血病を生成します。 血液中に白血病の発生が見られる場合 (8 ～ 10 週間)、マウスの血清で MIF 発現を測定します。 マウスは無作為に 3 つのグループに分けられ、1 グループあたり 7 匹のマウスが使用されます。1 つのグループは市販の MIF 阻害剤 (ISO-1) で処理され、2 つ目のグループは抗 MIF 抗体で処理され、1 つのグループはビヒクルで 3 週間処理されます。 （週に1回の注射）。 次に、マウスを監視して、毎週の採血と抗ヒトCD45染色を使用して、前白血病の生着とAMLの発生を検出します。

TET2 shRNAを発現するレンチベクターで形質導入された臍帯血CD34+細胞による異種移植のモデルが開発されました。 これらの操作された CD34 陽性細胞は、MIF の発現と分泌の増加を示し、多系列 NSG 移植の強化を示しています。 コントロール細胞と比較した場合、MIF阻害剤または抗MIF抗体を使用したMIFの阻害が、TET2枯渇細胞による増強された多系列NSG生着の修正につながるかどうかを試験する。 同様の実験は、現在研究室で利用可能な DNMT3A shRNA を使用して DNMT3A 枯渇モデルで実行されます。 さらに、MIF 阻害 (阻害剤および抗体) および組換えヒト MIF の効果は、未処理の正常な臍帯血 CD34+ 細胞の NSG 再増殖アッセイで分析されます。

1.6。 持続性クローン造血（DNMT3A / TET2変異体）を有する完全寛解患者からの細胞を移植したNSGマウスにおけるMIF阻害また、残存する前白血病幹細胞による NSG の再増殖に対抗することもできます。

MIF 阻害は、マウスの AML 発症を損なうと予想されます。 ただし、抗MIF抗体または阻害剤の安定性と副作用は、治療を受けた動物では問題になる可能性があります。 この場合、NSG マウスに注射する前に、shRNA を使用して AML 細胞の MIF をノックダウンします。 別の問題は、モデルの関連性を高めるために、異種移植時に MSC を同時注入する必要がある場合があります。 必要に応じて、通常の MSC と AML MSC を収集、準備し、AML 細胞と同時注入します。

1.7。 TET2 枯渇細胞における MIF のアップレギュレーションの完全な特徴付け TET2 が遺伝子調節にどのように影響するかは、まだ完全には理解されていません。 最近、Cao X のチームは、Tet2 の喪失がいくつかの炎症メディエーターのアップレギュレーションをもたらすことを示しました。 このモデルでは、Tet2 が Hdac2 をリクルートし、ヒストンの脱アセチル化を介して Il6 の転写を抑制しました。 TET2 は、カスミ細胞の CpG アイランドに豊富に存在する MIF 遺伝子の近位プロモーターに結合することがわかっています。 TET2 が失われると、EGR1 を介していくつかの白血病モデルで MIF が蓄積されます。 i) MIF プロモーターのメチル化は、正常な CD34+ 細胞 (20 サンプル) および c) のようにソートされた AML からの細胞集団 (150 サンプル) におけるバイサルファイト処理後の配列決定によって分析されます。 AML前白血病幹細胞は、他のモデルで観察されるように、MIF発現との相関関係があるかどうかを確認します。iii) コントロールおよびAML患者サンプルのEGR1、H3K4me3、H3K27me3、およびHDAC2について、MIFプロモーターに焦点を当てたChIP-PCR分析を実行します。 EGR1 がこのシステムに関与していない場合は、MIF プロモーター ルシフェラーゼ アッセイを使用して、AML サンプルのアップレギュレーションに不可欠な転写因子部位を特定し、ChIP-PCR によってターゲットを検証します。 これらの技術はすべて利用可能です。

1.8。 MSC と AML 細胞または正常な HSPC との間の双方向通信 AML 細胞における MIF 過剰発現の影響は、正常な MSC の生理機能 (分化、造血の維持、サイトカイン/ケモカインの産生、インタラクトーム) でテストされます。 この目的のために、成体骨髄からの正常な一次 MSC (既に入手可能) を分離し、記載されているように増殖させます (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260)。 細胞は継代 2 (P2) まで増幅されます。 ＭＳＣを異なる濃度の組換えＭＩＦで２４および４８時間処理し、サイトカイン／ケモカインの増殖、産生を評価する。 MIF が解糖を刺激することが報告されているため、MSC のミトコンドリア呼吸と解糖を測定し (Seahorse XF 細胞外フラックス アナライザー)、MIF による代謝を測定することにより、MSC のエネルギー代謝における MIF の効果も解読されます。高スループットの多重フィンガープリンティング (Omnilog Biolog) を使用した署名。 AML 細胞による MIF 過剰発現の影響をモデル化するために、MIF を発現するかどうか (shRNA) のヒト初代 AML 細胞 (5 サンプル) 間の共培養実験を行います。 24 時間および 48 時間後に、MSC を選別し、増殖、細胞周期、および骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価します。 以前の研究は、MIF-CXCR4 が in vivo での腫瘍への MSC 動員の新しい軸であることを示しています。

したがって、組換えＭＩＦがインビトロトランスウェルアッセイを用いてＭＳＣを動員できるかどうかが研究される。 MSCの動員に対するAML細胞によるMIF産生の効果は、AML調整培地を使用してテストされます。 MIF shRNA で操作された AML 細胞は、このコンテキストで使用されます。 MSC も MIF 産生に寄与している可能性を排除できないため、AML 細胞と共培養した正常な初代 MSC によって mRNA 発現をテストします。

組換え MIF は、MSC の増殖、細胞周期、分化能、または移動のいずれかに影響を与えると予想されます。 ただし、BM 微小環境で生成された MIF は、骨芽細胞、内皮細胞またはマクロファージを含む幹細胞ニッチの他の集団の生物学を変更することもできます。 MIF が影響を与える可能性のある代替細胞を調査するために、これらの集団に対するその効果をテストします。 MSC は、骨芽細胞、脂肪細胞、または軟骨細胞に分化するように誘導されます。 その後、MIF を追加して、目的の集団の増殖、細胞周期、移動を調査します。 骨芽細胞および内皮細胞への影響は、それぞれ MG63 および Huvec 細胞株を使用してモデル化されます。

1.9。 研究対象集団 1.9.1. 参加者の募集 新しくAMLと診断された300人の成人患者（> 18）が研究に含まれます。 Saint-Antoine病院で2015年11月以降に診断された85人の患者が遡及的に研究に含まれます。 サンアントワーヌ病院とトゥール大学病院で新たにAMLと診断された215人の患者が前向きに含まれます[年間100人以上のAML患者がサンアントワーヌ病院（年間70人以上の患者）とトゥール大学病院に紹介されます。年）]。

1.9.2.参加者のフォローアップ

患者のサンプル収集:

この研究では、標準治療の血液および骨髄サンプルのみが使用されます。

• 生化学、血球数、免疫表現型検査、細胞遺伝学、分子生物学分析、および腫瘍バンク凍結保存のための血液サンプル
• 免疫表現型検査、細胞遺伝学、分子生物学分析、および腫瘍バンク凍結保存のための骨髄サンプル

時点:

標準治療時点のサンプルのみが収集されます。

• 診断時点（0日目、Dxサンプル）
• 化学療法の最初のコースの後（C1時点）
• 化学療法の 2 コース後 (C2 時点)
• 3回目の化学療法終了後（C3時点）

• 再発・難治の場合は、

  • 最初の再発または難治性（RR1）の診断時
  • 2回目の再発または難治性（RR2）の診断時
• 診断後1、2、3年での長期寛解対照サンプル（LTR1、2、3）