MIF involvering i AML (MIFAML)

Undersøgelsen har til formål at studere involveringen af ​​MIF i voksen AML.

1. BESKRIVELSE AF ELEMENTET ELLER ELEMENTER UNDER UNDERSØGELSE 1.1. Måling af MIF-koncentrationer Plasma- og BM-supernatant fra patienter og kontroller (100 aldersmatchede kontroller for blod og BM-plasma, tilgængelig på Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839) vil blive analyseret ved ELISA. BM-supernatanter vil blive opnået efter en 2-trins centrifugeringsprocedure: 1 mL frisk BM fra AML-patienter eller kontrol-BM vil blive centrifugeret ved 540 g i 5 minutter for at genvinde levedygtige celler i pelleten (til cytometriske og ekspressionsundersøgelser); supernatanten vil blive centrifugeret ved 1000 g/15 min/4°C for at fremstille plasmaet. MIF-koncentrationer i BM og blodplasma vil blive systematisk sammenlignet. Da MIF-koncentrationer kan blive påvirket af forskellige faktorer, herunder inflammation, leukocytose og monocytose, vil blodcelletal og plasma C-reaktive proteinniveauer blive målt og taget i betragtning ved fortolkningen af ​​dataene.

1.2. Måling af MIF-, CD74- og CXCR4-ekspression Hæmatopoietiske stamceller, progenitorceller og blaster fra AML-patienter vil blive sorteret efter ekspressionen af ​​CD34-, CD38-, CD90-, CD45-RA-, IL-3R-antigener under hensyntagen til den initiale immunfænotype af sygdommen. Hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller fra kontrol-BM-prøver vil blive sorteret på samme måde. MIF, CD74 og CXCR4 RNA ekspression vil blive undersøgt ved kvantitativ RT-PCR i sorterede celle subpopulationer. Overfladeekspressionen af ​​CXCR4 og anti-CD74 samt intracellulær CD74 vil blive undersøgt ved multiparametrisk flow med cytometri.

1.3. Analyse af MIF-, CD74-, CXCR4-ekspression og MIF-koncentrationer på tidspunktet for fuldstændig remission.

Analyserne udført i a) og b) vil blive gentaget i komplette remissionsprøver hos 30 til 50 udvalgte patienter. Patienterne vil blive udvalgt i henhold til deres respons på behandlingen (vurdering af fuldstændig remission og normale blodtal) og til genotypen af ​​deres sygdom (15-25 patienter med enten TET2- eller DNMT3A-mutationer ved diagnose versus 15-25 patienter uden disse mutationer) . Prøver vil blive indsamlet efter to kemoterapiforløb på tidspunktet for remissionsevaluering. Når det er muligt, vil knoglemarvskontroller af patienter i langvarig remission (> 1 år efter diagnosen) blive indsamlet og undersøgt. I mellemtiden vil NGS-, ddPCR-, FISH- eller RT-PCR-teknikker blive brugt til at vurdere persistensen eller fraværet af de indledende AML-læsioner.

Det forventes, at der vil blive opnået komplet materiale for 80 % af inkluderede patienter, hvilket gør målet om 240 patienter opnåeligt på mindre end tre år. Celleoprensning kan være et problem i forbindelse med AML med afvigende immunfænotype: dette vil blive taget i betragtning ved brug af passende FACS-protokoller. Med hensyn til fokus på MIF-pathway kan det ikke udelukke, at andre kemokiner/cytokiner eller andre molekyler kan være involveret i kommunikationen af ​​AML-celler og deres mikromiljø. Således vil alikvoter af BM og blodplasma blive kryokonserveret for at tillade en forfining af vores strategi (for eksempel at udføre cytokin-arrays, ELISA eller MS-analyser, som er tilgængelige på Saint-Antoine Hospital).

1.4. Xenotransplantationsmodel af primær AML i NSG-mus Xenotransplantationsmodeller af primære AML-celler er blevet udviklet i en kohorte på 70 AML'er, hvor MIF-ekspression vil blive analyseret, den cytogenetiske og molekylære genotype, og korrelere disse parametre til forskellige indpodningsfænotyper.

1.5. MIF-hæmning i NSG-mus transplanteret med AML-celler og i NSG-mus transplanteret med TET2-depleteret eller DNMT3A-depleteret navlestrengsblod-HSPC'er MIF'er rolle på leukæmiudvikling i NSG-mus xenotransplanteret med primære celler vil blive tilgået. I disse eksperimenter vil primære AML-patientceller fra 6 patienter med TET2-mutationer af vores kohorte, som engrafterer, blive brugt til at generere leukæmi. Når leukæmiudvikling vil ses i blod (mellem 8 til 10 uger), vil MIF-ekspression blive målt i serum fra mus. Mus vil blive randomiseret i tre grupper med 7 mus pr. gruppe: En gruppe vil blive behandlet med en kommercielt tilgængelig MIF-hæmmer (ISO-1) og en anden gruppe med et anti-MIF-antistof, og en gruppe vil blive behandlet af vehikelen i tre uger (en injektion om ugen). Mus vil derefter blive overvåget for at detektere præ-leukæmisk engraftment og AML-udvikling ved hjælp af ugentlig blodprøvetagning og anti-human CD45-farvning.

En model for xenotransplantation af CD34+-celler fra navlestrengsblod transduceret med lentivectors, der udtrykker TET2 shRNA'er, er blevet udviklet. Disse konstruerede CD34-positive celler viste øget MIF-ekspression og sekretion og demonstrerer forbedret multilineage NSG-engraftment. Il vil blive testet, om inhibering af MIF under anvendelse af MIF-inhibitor eller anti-MIF-antistof fører til en korrektion af den forbedrede multilineage NSG-engraftment af TET2-depleterede celler sammenlignet med kontrolceller. Lignende eksperimenter vil blive udført med en DNMT3A-udtømt model ved hjælp af DNMT3A shRNA'er, der i øjeblikket er tilgængelige i laboratoriet. Desuden vil virkningerne af MIF-hæmning (inhibitor og antistof) og rekombinant human MIF blive analyseret i NSG-genpopulationsassays af ubehandlede normale CD34+-celler fra navlestrengsblod.

1.6. MIF-hæmning i NSG-mus transplanteret med celler fra patienter i fuldstændig remission med vedvarende klonal hæmatopoiese (DNMT3A / TET2-mutant) Komplette remissionsprøver fra seks patienter med vedvarende klonal hæmatopoiese i fuldstændig remission vil blive udvalgt og behandlet som i a) for at teste om MIF-hæmning er også i stand til at modvirke NSG-repopulation af resterende præ-leukæmiske stamceller.

Det forventes, at MIF-hæmning vil hæmme AML-udvikling hos mus. Stabilitet og bivirkninger af anti-MIF-antistof eller -hæmmere kan dog være et problem hos behandlede dyr. I dette tilfælde vil shRNA'er blive brugt til at slå ned MIF i AML-celler før injektion til NSG-mus. Et andet problem kan være behovet for co-injektion af MSC'er på tidspunktet for xenotransplantation for at øge modellens relevans. Om nødvendigt vil normale MSC'er og AML MSC'er blive indsamlet, klargjort og co-injiceret med AML-celler.

1.7. Fuld karakterisering af opreguleringen af ​​MIF i TET2-udtømte celler Hvordan TET2 kan påvirke genregulering er stadig ikke fuldstændigt forstået. For nylig har Cao X's team vist, at tab af Tet2 resulterede i opregulering af flere inflammatoriske mediatorer. I denne model rekrutterede Tet2 Hdac2 og undertrykte transkription af Il6 via histon-deacetylering. Det har vist sig, at TET2 binder den proksimale promotor af MIF-genet, som er beriget i CpG-øer i Kasumi-celler. Tab af TET2 resulterer i MIF-akkumulering i flere leukæmimodeller gennem EGR1. i) MIF-promotormethylering vil blive analyseret ved sekventering efter bisulfitbehandling i normale CD34+-celler (20 prøver) og cellepopulationer fra AML'er sorteret som i c)(150 prøver) ii) EGR1 mRNA-ekspression vil blive analyseret ved qRT-PCR i normal og AML præ-leukæmiske stamceller for at se, om der er en sammenhæng med MIF-ekspression som observeret i andre modeller iii) ChIP-PCR-analyser med fokus på MIF-promotor vil blive udført for EGR1, H3K4me3, H3K27me3 og HDAC2 i kontrol- og AML-patientprøver. Hvis EGR1 ikke er involveret i dette system, vil MIF-promotorluciferaseassay blive brugt til at identificere transkriptionsfaktorsteder, der er essentielle for dets opregulering i AML-prøver og validere målene ved ChIP-PCR. Alle disse teknologier er tilgængelige.

1.8. tovejskommunikation mellem MSC'er og AML-celler eller normale HSPC'er Virkningen af ​​MIF-overekspression i AML-celler vil blive testet på fysiologien af ​​normale MSC'er (differentiering, opretholdelse af hæmatopoiesis, produktion af cytokiner/kemokiner, interaktom). Til dette formål vil normale primære MSC'er fra voksen knoglemarv (allerede tilgængelig) blive isoleret og udvidet som beskrevet (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). Cellerne vil blive amplificeret op til passage 2 (P2). MSC'er vil blive behandlet med forskellige koncentrationer af rekombinant MIF i 24 og 48 timer, og proliferationen, produktionen af ​​cytokiner/kemokiner vil blive evalueret. Da det er blevet rapporteret, at MIF stimulerer glykolyse, vil virkningerne af MIF også dechifreres i det energiske metabolisme af MSC'er ved at måle mitokondriel respiration og glykolyse af MSC'er (Seahorse XF ekstracellulær fluxanalysator) og ved at bestemme deres MIF-inducerede metaboliske signatur ved hjælp af multiplekset fingeraftryk med høj kapacitet (Omnilog Biolog). For at modellere virkningerne af MIF-overekspression af AML-celler, vil udføre co-kultur eksperimenter mellem humane primære AML-celler (5 prøver), der udtrykker eller ej (shRNA) af MIF. Efter 24 og 48 timer vil MSC'er blive sorteret, og deres proliferation, cellecyklus og differentieringspotentiale til osteoblaster, adipocytter og chondrocytter vil blive evalueret. Tidligere undersøgelser indikerer, at MIF-CXCR4 er en ny akse for MSC-rekruttering til tumorer in vivo.

Det vil således blive undersøgt, om rekombinant MIF kan rekruttere MSC'er ved hjælp af in vitro transwell-assays. Effekten af ​​MIF-produktion af AML-celler på MSCs rekruttering vil blive testet ved hjælp af AML-konditioneret medium. AML-celler konstrueret med MIF shRNA vil blive brugt i denne sammenhæng. Da det ikke kan udelukke, at MSC'er også kan bidrage til MIF-produktion, vil mRNA-ekspression blive testet af primær normal MSC co-dyrket med AML-celler.

Det forventes, at rekombinant MIF vil have en indvirkning på enten proliferation, cellecyklus, differentieringspotentiale eller migration af MSC'er. Imidlertid kunne MIF produceret i BM mikromiljø også modificere biologien af ​​andre populationer af stamcelle nichen, herunder osteoblaster, endotelceller eller makrofager. For at undersøge alternative celler, som MIF kan have en indflydelse på, vil det blive testet dets virkninger på disse populationer. MSC'er vil blive induceret til at differentiere til osteoblaster, adipocytter eller chondrocytter. MIF vil derefter blive tilføjet for at undersøge proliferation, cellecyklus og migration af populationer af interesse. Effekt på osteoblaster og endotelceller vil blive modelleret ved hjælp af henholdsvis MG63 og Huvec cellelinjer.

1.9. Undersøgelsespopulation 1.9.1. Deltagerrekruttering 300 voksne patienter (>18) nydiagnosticeret med AML vil blive inkluderet i undersøgelsen. 85 patienter diagnosticeret siden november 2015 på Saint-Antoine Hospital vil retrospektivt blive inkluderet i undersøgelsen. 215 patienter nydiagnosticeret med AML på Saint-Antoine og Tours universitetshospitaler vil prospektivt blive inkluderet [>100 AML patienter om året henvises til Saint-Antoine hospital (>70 patienter om året) og Tours Universitetshospital for AML (>30 patienter pr. år)].

1.9.2. Deltageropfølgning

Indsamling af patientprøver:

Kun standardpleje blod- og knoglemarvsprøver vil blive brugt i undersøgelsen:

• Blodprøver til biokemi, blodcelletal, immunfænotypning, cytogenetik, molekylærbiologiske analyser og tumorbank-kryokonservering
• Knoglemarvsprøver til immunfænotypning, cytogenetik, molekylærbiologiske analyser og kryokonservering af tumorbanker

Tidspunkter:

Kun prøver af standardplejetidspunkter vil blive indsamlet:

• Diagnosetidspunkt (dag 0, Dx prøve)
• Efter det første kemoterapiforløb (tidspunkt C1)
• Efter det andet kemoterapiforløb (tidspunkt C2)
• Efter det tredje kemoterapiforløb (tidspunkt C3)

• I tilfælde af tilbagefald eller refraktæritet,

  • på tidspunktet for diagnosen første tilbagefald eller refraktæritet (RR1)
  • på tidspunktet for diagnosen andet tilbagefald eller refraktæritet (RR2)
• Langsigtede remissionskontrolprøver 1, 2, 3 år efter diagnosen (LTR1, 2, 3)