Zaangażowanie MIF w AML (MIFAML)

Badanie ma na celu zbadanie udziału MIF w AML u dorosłych.

1. OPIS ELEMENTU LUB ELEMENTÓW BADANYCH 1.1. Pomiar stężeń MIF Supernatant osocza i BM od pacjentów i kontroli (100 dopasowanych wiekowo kontroli dla krwi i osocza BM, dostępne w Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839) zostanie przeanalizowany metodą ELISA. Supernatanty BM zostaną uzyskane po dwuetapowej procedurze wirowania: 1 ml świeżego BM od pacjentów z AML lub kontrolnego BM będzie odwirowywany przy 540 g przez 5 min w celu odzyskania żywotnych komórek w osadzie (do badań cytometrycznych i ekspresyjnych); supernatant zostanie odwirowany przy 1000 g/15 min/4°C w celu przygotowania osocza. Stężenia MIF w BM i osoczu krwi będą systematycznie porównywane. Ponieważ na stężenia MIF mogą wpływać różne czynniki, w tym zapalenie, leukocytoza i monocytoza, morfologia krwi i poziom białka C-reaktywnego w osoczu zostaną zmierzone i uwzględnione w interpretacji danych.

1.2. Pomiar ekspresji MIF, CD74 i CXCR4 Hematopoetyczne komórki macierzyste, komórki progenitorowe i blasty pochodzące od pacjentów z AML zostaną posortowane według ekspresji antygenów CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R, z uwzględnieniem początkowego immunofenotypu choroba. Hematopoetyczne komórki macierzyste i komórki progenitorowe z kontrolnych próbek BM zostaną posortowane podobnie. Ekspresja RNA MIF, CD74 i CXCR4 będzie badana za pomocą ilościowego RT-PCR w sortowanych subpopulacjach komórek. Powierzchniowa ekspresja CXCR4 i anty-CD74, jak również wewnątrzkomórkowy CD74 będzie badana za pomocą multiparametrycznego przepływu z cytometrią.

1.3. Analiza ekspresji MIF, CD74, CXCR4 i stężeń MIF w czasie całkowitej remisji.

Analizy przeprowadzone w punktach a) i b) zostaną powtórzone w próbkach z całkowitą remisją u 30 do 50 wybranych pacjentów. Pacjenci zostaną wybrani na podstawie ich odpowiedzi na leczenie (ocena całkowitej remisji i prawidłowej morfologii krwi) oraz genotypu ich choroby (15-25 pacjentów z mutacjami TET2 lub DNMT3A w chwili rozpoznania w porównaniu z 15-25 pacjentami bez tych mutacji) . Próbki zostaną pobrane po dwóch kursach chemioterapii w czasie oceny remisji. Jeśli to możliwe, zostaną zebrane i zbadane kontrole szpiku kostnego pacjentów w długoterminowej remisji (> 1 rok po diagnozie). W międzyczasie techniki NGS, ddPCR, FISH lub RT-PCR zostaną wykorzystane do oceny utrzymywania się lub braku początkowych zmian AML.

Oczekuje się, że pełny materiał zostanie uzyskany dla 80% włączonych pacjentów, dzięki czemu cel 240 pacjentów będzie możliwy do osiągnięcia w czasie krótszym niż trzy lata. Oczyszczanie komórek może stanowić problem w kontekście AML z nieprawidłowym immunofenotypem: zostanie to wzięte pod uwagę przy użyciu odpowiednich protokołów FACS. Jeśli chodzi o skupienie się na szlaku MIF, nie można wykluczyć, że inne chemokiny/cytokiny lub inne cząsteczki mogą być zaangażowane w komunikację komórek AML i ich mikrośrodowiska. Dlatego porcje BM i osocza krwi będą kriokonserwowane, aby umożliwić udoskonalenie naszej strategii (na przykład w celu wykonania macierzy cytokin, testów ELISA lub analiz MS, które są dostępne w szpitalu Saint-Antoine).

1.4. Model ksenotransplantacji pierwotnej AML u myszy NSG Modele ksenotransplantacji pierwotnych komórek AML opracowano w kohorcie 70 AML, w których analizowana będzie ekspresja MIF, genotyp cytogenetyczny i molekularny oraz korelacja tych parametrów z różnymi fenotypami wszczepiania.

1.5. Hamowanie MIF u myszy NSG z przeszczepionymi komórkami AML i myszami NSG z przeszczepionymi HSPC z krwi pępowinowej zubożonymi w TET2 lub DNMT3A Zostanie omówiona rola MIF w rozwoju białaczki u myszy NSG z ksenoprzeszczepem komórek pierwotnych. W tych eksperymentach pierwotne komórki pacjentów z AML od 6 pacjentów z mutacjami TET2 z naszej kohorty, które zostaną wszczepione, zostaną wykorzystane do wygenerowania białaczki. Gdy rozwój białaczki będzie obserwowany we krwi (między 8 a 10 tygodniem), ekspresję MIF będzie mierzono w surowicy myszy. Myszy zostaną losowo podzielone na trzy grupy po 7 myszy na grupę: jedna grupa będzie leczona dostępnym w handlu inhibitorem MIF (ISO-1), a druga grupa przeciwciałem anty-MIF, a jedna grupa będzie leczona nośnikiem przez trzy tygodnie (jeden zastrzyk na tydzień). Myszy będą następnie monitorowane w celu wykrycia wszczepienia przed białaczką i rozwoju AML przy użyciu cotygodniowego pobierania krwi i barwienia anty-ludzkiego CD45.

Opracowano model ksenotransplantacji komórek CD34+ z krwi pępowinowej transdukowanych lentiwektorami eksprymującymi shRNA TET2. Te zmodyfikowane komórki CD34-dodatnie wykazywały zwiększoną ekspresję i wydzielanie MIF oraz demonstrowały wzmocnione wieloliniowe wszczepienie NSG. Zostanie przetestowane, czy hamowanie MIF przy użyciu inhibitora MIF lub przeciwciała anty-MIF prowadzi do korekty wzmocnionego wieloliniowego wszczepienia NSG przez komórki zubożone w TET2 w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Podobne eksperymenty zostaną przeprowadzone z modelem zubożonym w DNMT3A przy użyciu shRNA DNMT3A, które są obecnie dostępne w laboratorium. Ponadto wpływ hamowania MIF (inhibitora i przeciwciała) i rekombinowanego ludzkiego MIF będzie analizowany w testach repopulacji NSG nieprzetworzonych normalnych komórek CD34+ krwi pępowinowej.

1.6. Hamowanie MIF u myszy NSG, którym przeszczepiono komórki od pacjentów w całkowitej remisji z przetrwałą hematopoezą klonalną (mutant DNMT3A / TET2) Próbki całkowitej remisji od sześciu pacjentów z przetrwałą hematopoezą klonalną w całkowitej remisji zostaną wybrane i potraktowane jak w a) w celu sprawdzenia, czy hamowanie MIF jest również w stanie przeciwdziałać ponownej populacji NSG przez resztkowe przedbiałaczkowe komórki macierzyste.

Oczekuje się, że hamowanie MIF zaburzy rozwój AML u myszy. Jednak stabilność i skutki uboczne przeciwciała lub inhibitorów anty-MIF mogą stanowić problem u leczonych zwierząt. W tym przypadku shRNA zostaną użyte do obalenia MIF w komórkach AML przed wstrzyknięciem myszom NSG. Innym problemem może być konieczność jednoczesnego wstrzykiwania MSC w czasie ksenotransplantacji w celu zwiększenia trafności modelu. W razie potrzeby normalne MSC i AML MSC zostaną zebrane, przygotowane i wstrzyknięte razem z komórkami AML.

1.7. Pełna charakterystyka regulacji w górę MIF w komórkach zubożonych w TET2 W jaki sposób TET2 może wpływać na regulację genów, wciąż nie jest całkowicie zrozumiała. Niedawno zespół Cao X wykazał, że utrata Tet2 spowodowała zwiększenie liczby kilku mediatorów stanu zapalnego. W tym modelu Tet2 rekrutował Hdac2 i tłumił transkrypcję Il6 poprzez deacetylację histonów. Stwierdzono, że TET2 wiąże proksymalny promotor genu MIF, który jest wzbogacony w wyspy CpG w komórkach Kasumi. Utrata TET2 powoduje akumulację MIF w kilku modelach białaczkowych przez EGR1. i) Metylacja promotora MIF będzie analizowana przez sekwencjonowanie po traktowaniu wodorosiarczynem w normalnych komórkach CD34+ (20 próbek) i populacjach komórek z AML posortowanych jak w c) (150 próbek) ii) Ekspresja mRNA EGR1 będzie analizowana za pomocą qRT-PCR w normalnych i Przedbiałaczkowe komórki macierzyste AML w celu sprawdzenia, czy istnieje korelacja z ekspresją MIF obserwowaną w innych modelach iii) Analizy ChIP-PCR koncentrujące się na promotorze MIF zostaną przeprowadzone dla EGR1, H3K4me3, H3K27me3 i HDAC2 w próbkach kontrolnych i pacjentów z AML. Jeśli EGR1 nie jest zaangażowany w ten system, test lucyferazy promotora MIF zostanie użyty do identyfikacji miejsc czynnika transkrypcyjnego, które są niezbędne do jego regulacji w górę w próbkach AML i walidacji celów za pomocą ChIP-PCR. Wszystkie te technologie są dostępne.

1.8. dwukierunkowa komunikacja między MSC a komórkami AML lub normalnymi HSPC Wpływ nadekspresji MIF w komórkach AML zostanie przetestowany na fizjologię normalnych MSC (różnicowanie, podtrzymywanie hematopoezy, wytwarzanie cytokin/chemokin, interaktom). W tym celu normalne pierwotne MSC z dorosłego szpiku kostnego (już dostępne) zostaną wyizolowane i namnożone zgodnie z opisem (Reinisch A i in., Blood 2015, 125:249-260). Komórki będą amplifikowane do pasażu 2 (P2). MSC będą traktowane różnymi stężeniami rekombinowanego MIF przez 24 i 48 godzin i oceniana będzie proliferacja, wytwarzanie cytokin/chemokin. Ponieważ doniesiono, że MIF stymuluje glikolizę, skutki MIF również zostaną rozszyfrowane w metabolizmie energetycznym MSC poprzez pomiar oddychania mitochondrialnego i glikolizy MSC (analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XF) oraz poprzez określenie ich metabolizmu indukowanego przez MIF podpis przy użyciu multipleksowanego odcisku palca o dużej przepustowości (Omnilog Biolog). Aby modelować skutki nadekspresji MIF przez komórki AML, przeprowadzą eksperymenty wspólnej hodowli między ludzkimi pierwotnymi komórkami AML (5 próbek), które wyrażają lub nie (shRNA) MIF. Po 24 i 48 godzinach komórki MSC zostaną posortowane i oceniony zostanie ich potencjał proliferacji, cyklu komórkowego i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty. Wcześniejsze badania wskazują, że MIF-CXCR4 jest nową osią rekrutacji MSC do nowotworów in vivo.

W związku z tym zostanie zbadane, czy rekombinowany MIF może rekrutować MSC przy użyciu testów transwellowych in vitro. Wpływ produkcji MIF przez komórki AML na rekrutację MSC zostanie przetestowany przy użyciu kondycjonowanej pożywki AML. W tym kontekście zostaną użyte komórki AML zmodyfikowane za pomocą shRNA MIF. Ponieważ nie można wykluczyć, że MSC mogą również przyczyniać się do produkcji MIF, ekspresja mRNA będzie testowana przez pierwotne normalne MSC hodowane wspólnie z komórkami AML.

Oczekuje się, że rekombinowany MIF będzie miał wpływ na proliferację, cykl komórkowy, potencjał różnicowania lub migrację MSC. Jednak MIF wytwarzane w mikrośrodowisku BM mogą również modyfikować biologię innych populacji niszy komórek macierzystych, w tym osteoblastów, komórek śródbłonka lub makrofagów. Aby zbadać alternatywne komórki, na które MIF może mieć wpływ, zostanie przetestowany jego wpływ na te populacje. MSC będą indukowane do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty lub chondrocyty. Następnie zostaną dodane MIF w celu zbadania proliferacji, cyklu komórkowego i migracji populacji będących przedmiotem zainteresowania. Wpływ na osteoblasty i komórki śródbłonka będzie modelowany przy użyciu odpowiednio linii komórkowych MG63 i Huvec.

1.9. Badana populacja 1.9.1. Rekrutacja uczestników Do badania zostanie włączonych 300 dorosłych pacjentów (>18) z nowo zdiagnozowaną AML. 85 pacjentów zdiagnozowanych od listopada 2015 roku w szpitalu Saint-Antoine zostanie retrospektywnie włączonych do badania. 215 pacjentów z nowo zdiagnozowaną AML w szpitalach uniwersyteckich Saint-Antoine i Tours zostanie włączonych prospektywnie [>100 pacjentów z AML rocznie jest kierowanych do szpitala Saint-Antoine (>70 pacjentów rocznie) i Tours University Hospital z powodu AML (>30 pacjentów na rok)].

1.9.2. Śledzenie uczestników

Pobieranie próbek od pacjentów:

W badaniu zostaną wykorzystane wyłącznie standardowe próbki krwi i szpiku kostnego:

• Próbki krwi do biochemii, morfologii krwi, immunofenotypowania, cytogenetyki, analiz biologii molekularnej i kriokonserwacji banku guzów
• Próbki szpiku kostnego do immunofenotypowania, cytogenetyki, analiz biologii molekularnej i kriokonserwacji banku guzów

Punkty czasowe:

Zostaną pobrane tylko próbki punktu czasowego standardowej opieki:

• Punkt czasowy diagnozy (dzień 0, próbka Dx)
• Po pierwszym kursie chemioterapii (punkt czasowy C1)
• Po drugim kursie chemioterapii (punkt czasowy C2)
• Po trzecim kursie chemioterapii (punkt czasowy C3)

• W przypadku nawrotu lub oporności,

  • w momencie rozpoznania pierwszego nawrotu lub oporności na leczenie (RR1)
  • w momencie rozpoznania drugiego nawrotu lub oporności (RR2)
• Próbki kontrolne długoterminowej remisji po 1, 2, 3 latach od diagnozy (LTR1, 2, 3)