MIF Coinvolgimento in AML (MIFAML)

Lo studio mira a studiare il coinvolgimento della MIF nell'AML degli adulti.

1. DESCRIZIONE DELL'ELEMENTO O DEGLI ELEMENTI IN ESAME 1.1. Misurazione delle concentrazioni di MIF Plasma e surnatante BM da pazienti e controlli (100 controlli di età corrispondente per sangue e plasma BM, disponibili presso Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) sarà analizzato mediante ELISA. I surnatanti di BM saranno ottenuti dopo una procedura di centrifugazione in 2 fasi: 1 mL di BM fresco da pazienti affetti da AML o BM di controllo sarà centrifugato a 540 g per 5 min per recuperare cellule vitali nel pellet (per studi citometrici e di espressione); il supernatante sarà centrifugato a 1000 g/15 min/4°C per preparare il plasma. Le concentrazioni di MIF nel midollo osseo e nel plasma sanguigno saranno confrontate sistematicamente. Poiché le concentrazioni di MIF possono essere influenzate da diversi fattori, tra cui infiammazione, leucocitosi e monocitosi, la conta delle cellule del sangue e i livelli plasmatici di proteina C-reattiva saranno misurati e presi in considerazione nell'interpretazione dei dati.

1.2. Misurazione dell'espressione di MIF, CD74 e CXCR4 Cellule staminali emopoietiche, cellule progenitrici e blasti di pazienti affetti da AML saranno ordinati in base all'espressione degli antigeni CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R, tenendo conto dell'immunofenotipo iniziale di la malattia. Le cellule staminali emopoietiche e le cellule progenitrici dei campioni di midollo osseo di controllo saranno classificate in modo simile. L'espressione di MIF, CD74 e CXCR4 RNA sarà studiata mediante RT-PCR quantitativa in sottopopolazioni cellulari selezionate. L'espressione superficiale di CXCR4 e anti-CD74 così come il CD74 intracellulare sarà studiata mediante flusso multiparametrico con citometria.

1.3. Analisi dell'espressione di MIF, CD74, CXCR4 e concentrazioni di MIF al momento della remissione completa.

Le analisi eseguite in a) eb) saranno ripetute in campioni di remissione completa in 30-50 pazienti selezionati. I pazienti saranno selezionati in base alla loro risposta alla terapia (valutazione della remissione completa e conta ematica normale) e al genotipo della loro malattia (15-25 pazienti con mutazioni TET2 o DNMT3A alla diagnosi vs 15-25 pazienti senza queste mutazioni) . I campioni saranno raccolti dopo due cicli di chemioterapia al momento della valutazione della remissione. Quando possibile, saranno raccolti e studiati controlli del midollo osseo di pazienti in remissione a lungo termine (> 1 anno dopo la diagnosi). Nel frattempo, verranno utilizzate tecniche NGS, ddPCR, FISH o RT-PCR per valutare la persistenza o l'assenza delle lesioni AML iniziali.

Si prevede di ottenere materiale completo per l'80% dei pazienti inclusi, rendendo l'obiettivo di 240 pazienti realizzabile in meno di tre anni. La purificazione cellulare può essere un problema nel contesto dell'AML con immunofenotipo aberrante: questo sarà preso in considerazione mediante l'uso di protocolli FACS appropriati. Per quanto riguarda il focus sulla via MIF, non si può escludere che altre chemochine/citochine o altre molecole possano essere coinvolte nella comunicazione delle cellule AML e del loro microambiente. Pertanto, aliquote di BM e plasma sanguigno saranno crioconservate per consentire un raffinamento della nostra strategia (ad esempio per eseguire array di citochine, ELISA o analisi MS disponibili presso l'ospedale Saint-Antoine).

1.4. Modello di xenotrapianto di LMA primaria in topi NSG Modelli di xenotrapianto di cellule di LMA primarie sono stati sviluppati in una coorte di 70 AML in cui verrà analizzata l'espressione di MIF, il genotipo citogenetico e molecolare e correlare questi parametri a diversi fenotipi di attecchimento.

1.5. Inibizione della MIF in topi NSG trapiantati con cellule AML e in topi NSG trapiantati con HSPC da sangue cordonale depleti in TET2 o DNMT3A Verrà analizzato il ruolo della MIF sullo sviluppo della leucemia in topi NSG xenotrapiantati con cellule primarie. In questi esperimenti, le cellule primarie di pazienti affetti da LMA di 6 pazienti con mutazioni in TET2 della nostra coorte che si innestano verranno utilizzate per generare la leucemia. Quando lo sviluppo leucemico sarà osservato nel sangue (tra 8 e 10 settimane), l'espressione di MIF sarà misurata nel siero dei topi. I topi saranno randomizzati in tre gruppi con 7 topi per gruppo: un gruppo sarà trattato con un inibitore MIF disponibile in commercio (ISO-1) e un secondo gruppo con un anticorpo anti MIF e un gruppo sarà trattato dal veicolo per tre settimane (una iniezione alla settimana). I topi saranno quindi monitorati per rilevare l'attecchimento pre-leucemico e lo sviluppo di AML mediante prelievo di sangue settimanale e colorazione anti-CD45 umano.

È stato sviluppato un modello di xenotrapianto da cellule CD34+ del sangue cordonale trasdotte con lentivettori che esprimono shRNA TET2. Queste cellule CD34 positive ingegnerizzate hanno mostrato una maggiore espressione e secrezione di MIF e dimostrano un potenziamento dell'attecchimento di NSG multilineare. Verrà testato se l'inibizione di MIF utilizzando l'inibitore MIF o l'anticorpo anti MIF porta a una correzione dell'attecchimento di NSG multilineare potenziato da cellule deplete di TET2 rispetto alle cellule di controllo. Esperimenti simili saranno eseguiti con un modello depleto di DNMT3A utilizzando shRNA DNMT3A attualmente disponibili in laboratorio. Inoltre, gli effetti dell'inibizione della MIF (inibitore e anticorpo) e della MIF umana ricombinante saranno analizzati in saggi di ripopolamento di NSG di cellule CD34+ normali del sangue cordonale non processate.

1.6. Inibizione MIF in topi NSG trapiantati con cellule di pazienti in remissione completa con emopoiesi clonale persistente (mutante DNMT3A / TET2) Campioni di remissione completa da sei pazienti con emopoiesi clonale persistente in remissione completa saranno selezionati e trattati come in a) per verificare se l'inibizione MIF è anche in grado di contrastare il ripopolamento di NSG da parte di cellule staminali pre-leucemiche residue.

Si prevede che l'inibizione del MIF comprometta lo sviluppo dell'AML nei topi. Tuttavia, la stabilità e gli effetti collaterali degli anticorpi o degli inibitori anti MIF possono costituire un problema negli animali trattati. In questo caso, gli shRNA verranno utilizzati per abbattere il MIF nelle cellule AML prima dell'iniezione nei topi NSG. Un altro problema potrebbe essere la necessità di co-iniezione di MSC al momento dello xenotrapianto per aumentare la rilevanza del modello. Se necessario, MSC normali e MSC AML saranno raccolte, preparate e co-iniettate con cellule AML.

1.7. Caratterizzazione completa dell'up-regolazione di MIF nelle cellule impoverite di TET2 Il modo in cui TET2 potrebbe influire sulla regolazione genica rimane ancora non completamente compreso. Recentemente, il team di Cao X ha dimostrato che la perdita di Tet2 ha provocato la sovraregolazione di diversi mediatori dell'infiammazione. In questo modello, Tet2 ha reclutato Hdac2 e ha represso la trascrizione di Il6 tramite la deacetilazione dell'istone. È stato scoperto che TET2 lega il promotore prossimale del gene MIF che è arricchito nelle isole CpG nelle cellule Kasumi. La perdita di TET2 provoca l'accumulo di MIF in diversi modelli leucemici attraverso EGR1. i) La metilazione del promotore MIF sarà analizzata mediante sequenziamento dopo il trattamento con bisolfito in cellule normali CD34+ (20 campioni) e popolazioni cellulari da AML ordinate come in c) (150 campioni) ii) L'espressione dell'mRNA di EGR1 sarà analizzata mediante qRT-PCR in cellule normali e Cellule staminali pre-leucemiche AML per vedere se esiste una correlazione con l'espressione MIF come osservato in altri modelli iii) Le analisi ChIP-PCR incentrate sul promotore MIF saranno eseguite per EGR1, H3K4me3, H3K27me3 e HDAC2 nei campioni di controllo e pazienti AML. Se EGR1 non è coinvolto in questo sistema, il test luciferasi del promotore MIF verrà utilizzato per identificare i siti del fattore di trascrizione che sono essenziali per la sua up-regolazione nei campioni di AML e convalidare i bersagli mediante ChIP-PCR. Tutte queste tecnologie sono disponibili.

1.8. comunicazione bidirezionale tra MSC e cellule AML o HSPC normali L'impatto della sovraespressione di MIF nelle cellule AML sarà testato sulla fisiologia delle MSC normali (differenziazione, mantenimento dell'emopoiesi, produzione di citochine/chemochine, interattoma). A questo scopo, MSC primarie normali da midollo osseo adulto (già disponibili) saranno isolate ed espanse come descritto (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). Le Celle saranno amplificate fino al passaggio 2 (P2). Le MSC saranno trattate con diverse concentrazioni di MIF ricombinante per 24 e 48 ore e sarà valutata la proliferazione e la produzione di citochine/chemochine. Poiché è stato riportato che il MIF stimola la glicolisi, gli effetti del MIF verranno decifrati anche nel metabolismo energetico delle MSC misurando la respirazione mitocondriale e la glicolisi delle MSC (analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XF) e determinando il loro metabolismo metabolico indotto dal MIF firma utilizzando fingerprinting multiplex ad alto throughput (Omnilog Biolog). Per modellare gli effetti della sovraespressione di MIF da parte delle cellule AML, verranno eseguiti esperimenti di co-coltura tra cellule AML primarie umane (5 campioni) che esprimono o meno (shRNA) MIF. Dopo 24 e 48 ore, le MSC saranno selezionate e sarà valutata la loro proliferazione, ciclo cellulare e potenziale di differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti. Precedenti studi indicano che MIF-CXCR4 è un nuovo asse per il reclutamento di MSC nei tumori in vivo.

Pertanto si studierà se la MIF ricombinante possa reclutare MSC utilizzando saggi di transwell in vitro. L'effetto della produzione di MIF da parte delle cellule AML sul reclutamento di MSC sarà testato utilizzando un mezzo condizionato AML. In questo contesto verranno utilizzate cellule AML ingegnerizzate con MIF shRNA. Poiché non è possibile escludere che anche le MSC possano contribuire alla produzione di MIF, l'espressione dell'mRNA sarà testata da MSC primarie normali co-coltivate con cellule AML.

Si prevede che la MIF ricombinante avrà un impatto sulla proliferazione, sul ciclo cellulare, sul potenziale di differenziazione o sulla migrazione delle MSC. Tuttavia, il MIF prodotto nel microambiente BM potrebbe anche modificare la biologia di altre popolazioni della nicchia delle cellule staminali, inclusi osteoblasti, cellule endoteliali o macrofagi. Per indagare su cellule alternative su cui MIF potrebbe avere un impatto, ne testeremo gli effetti su queste popolazioni. Le MSC saranno indotte a differenziarsi in osteoblasti, adipociti o condrociti. MIF verrà quindi aggiunto per studiare la proliferazione, il ciclo cellulare e la migrazione delle popolazioni di interesse. L'effetto sugli osteoblasti e sulle cellule endoteliali sarà modellato utilizzando rispettivamente le linee cellulari MG63 e Huvec.

1.9. Popolazione studiata 1.9.1. Reclutamento dei partecipanti Nello studio saranno inclusi 300 pazienti adulti (>18) con nuova diagnosi di AML. 85 pazienti diagnosticati dal novembre 2015 all'ospedale Saint-Antoine saranno inclusi retrospettivamente nello studio. Saranno inclusi in modo prospettico 215 pazienti con nuova diagnosi di LMA presso gli ospedali universitari Saint-Antoine e Tours [>100 pazienti con LMA all'anno sono indirizzati all'ospedale Saint-Antoine (>70 pazienti all'anno) e all'ospedale universitario di Tours per AML (>30 pazienti all'anno) anno)].

1.9.2. Seguito dei partecipanti

Raccolta del campione del paziente:

Nello studio verranno utilizzati solo campioni di sangue e midollo osseo standard:

• Campioni di sangue per biochimica, conta delle cellule del sangue, immunofenotipizzazione, citogenetica, analisi di biologia molecolare e crioconservazione della banca dei tumori
• Campioni di midollo osseo per immunofenotipizzazione, citogenetica, analisi di biologia molecolare e crioconservazione di banche tumorali

Punti temporali:

Saranno raccolti solo campioni di punti temporali di cura standard:

• Punto temporale della diagnosi (giorno 0, campione Dx)
• Dopo il primo ciclo di chemioterapia (punto temporale C1)
• Dopo il secondo ciclo di chemioterapia (punto temporale C2)
• Dopo il terzo ciclo di chemioterapia (punto temporale C3)

• In caso di recidiva o refrattarietà,

  • al momento della diagnosi di prima recidiva o refrattarietà (RR1)
  • al momento della diagnosi di seconda recidiva o refrattarietà (RR2)
• Campioni di controllo della remissione a lungo termine a 1, 2, 3 anni dalla diagnosi (LTR1, 2, 3)