MIF Betrokkenheid bij AML (MIFAML)

De studie heeft tot doel de betrokkenheid van MIF bij volwassen AML te bestuderen.

1. BESCHRIJVING VAN HET ELEMENT OF DE ELEMENTEN DIE WORDEN ONDERZOCHT 1.1. Meting van MIF-concentraties Plasma- en BM-supernatant van patiënten en controles (100 leeftijdsgematchte controles voor bloed en BM-plasma, verkrijgbaar bij Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) zal worden geanalyseerd door ELISA. BM-supernatanten worden verkregen na een 2-staps centrifugatieprocedure: 1 ml verse BM van AML-patiënten of controle-BM wordt gedurende 5 minuten bij 540 g gecentrifugeerd om levensvatbare cellen in de pellet te herstellen (voor cytometrische en expressiestudies); het supernatant wordt gecentrifugeerd bij 1000 g/15 min/4°C om het plasma te bereiden. MIF-concentraties in BM en bloedplasma zullen systematisch worden vergeleken. Aangezien MIF-concentraties kunnen worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder ontsteking, leukocytose en monocytose, zullen het aantal bloedcellen en C-reactieve proteïnespiegels in het plasma worden gemeten en zal er bij de interpretatie van de gegevens rekening mee worden gehouden.

1.2. Meting van MIF-, CD74- en CXCR4-expressie Hematopoietische stamcellen, progenitorcellen en blasten van AML-patiënten zullen worden gesorteerd op basis van de expressie van CD34-, CD38-, CD90-, CD45-RA-, IL-3R-antigenen, rekening houdend met het initiële immunofenotype van de ziekte. Hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen van controle-BM-monsters zullen op dezelfde manier worden gesorteerd. MIF, CD74 en CXCR4 RNA-expressie zal worden bestudeerd door middel van kwantitatieve RT-PCR in gesorteerde celsubpopulaties. De oppervlakte-expressie van CXCR4 en anti-CD74 alsook intracellulair CD74 zal bestudeerd worden door middel van multiparametrische flow met cytometrie.

1.3. Analyse van MIF-, CD74-, CXCR4-expressie en MIF-concentraties op het moment van volledige remissie.

De analyses uitgevoerd in a) en b) zullen worden herhaald in volledige remissiemonsters bij 30 tot 50 geselecteerde patiënten. Patiënten zullen worden geselecteerd op basis van hun respons op de therapie (beoordeling van volledige remissie en normale bloedtellingen) en het genotype van hun ziekte (15-25 patiënten met TET2- of DNMT3A-mutaties bij diagnose versus 15-25 patiënten zonder deze mutaties) . Monsters zullen worden verzameld na twee chemokuren op het moment van remissie-evaluatie. Waar mogelijk zullen beenmergcontroles van patiënten in langdurige remissie (> 1 jaar na diagnose) worden verzameld en bestudeerd. In de tussentijd zullen NGS-, ddPCR-, FISH- of RT-PCR-technieken worden gebruikt om de persistentie of afwezigheid van de initiële AML-laesies te beoordelen.

Verwacht wordt dat voor 80% van de geïncludeerde patiënten volledig materiaal zal worden verkregen, waardoor de doelstelling van 240 patiënten in minder dan drie jaar haalbaar zal zijn. Celzuivering kan een probleem zijn in de context van AML met een afwijkend immunofenotype: hiermee zal rekening worden gehouden door het gebruik van geschikte FACS-protocollen. Wat betreft de focus op de MIF-route, kan niet worden uitgesloten dat andere chemokines/cytokines of andere moleculen betrokken kunnen zijn bij de communicatie van AML-cellen en hun micro-omgeving. Zo zullen aliquots van BM en bloedplasma worden gecryopreserveerd om een ​​verfijning van onze strategie mogelijk te maken (bijvoorbeeld om cytokine-arrays, ELISA of MS-analyses uit te voeren die beschikbaar zijn in het Saint-Antoine-ziekenhuis).

1.4. Xenotransplantatiemodel van primaire AML in NSG-muizen Xenotransplantatiemodellen van primaire AML-cellen zijn ontwikkeld in een cohort van 70 AML's waarin MIF-expressie zal worden geanalyseerd, het cytogenetische en moleculaire genotype, en deze parameters zullen correleren met verschillende entingsfenotypes.

1.5. MIF-remming in NSG-muizen getransplanteerd met AML-cellen en in NSG-muizen getransplanteerd met TET2-verarmde of DNMT3A-verarmde navelstrengbloed-HSPC's De rol van MIF op de ontwikkeling van leukemie in NSG-muizen xenotransplanted met primaire cellen zal worden benaderd. In deze experimenten zullen primaire AML-patiëntcellen van 6 patiënten met TET2-mutaties van ons cohort die zijn geënt, worden gebruikt om leukemie te genereren. Wanneer de ontwikkeling van leukemie in het bloed wordt gezien (tussen 8 en 10 weken), wordt de MIF-expressie gemeten in het serum van muizen. Muizen worden gerandomiseerd in drie groepen met 7 muizen per groep: één groep wordt behandeld met een in de handel verkrijgbare MIF-remmer (ISO-1) en een tweede groep met een anti-MIF-antilichaam en één groep wordt gedurende drie weken behandeld met het vehiculum (één injectie per week). Muizen zullen vervolgens worden gecontroleerd om pre-leukemische innesteling en AML-ontwikkeling te detecteren met behulp van wekelijkse bloedafname en anti-menselijke CD45-kleuring.

Er is een model ontwikkeld voor xenotransplantatie door CD34 + -cellen uit navelstrengbloed getransduceerd met lentivectoren die TET2-shRNA's tot expressie brengen. Deze gemanipuleerde CD34-positieve cellen vertoonden verhoogde MIF-expressie en -secretie en demonstreerden verbeterde multilineage NSG-implantatie. Il zal worden getest of remming van MIF met behulp van MIF-remmer of anti-MIF-antilichaam leidt tot een correctie van de verbeterde multilineage NSG-implantatie door TET2-verarmde cellen in vergelijking met controlecellen. Vergelijkbare experimenten zullen worden uitgevoerd met een DNMT3A-verarmd model met behulp van DNMT3A-shRNA's die momenteel beschikbaar zijn in het laboratorium. Bovendien zullen de effecten van MIF-remming (remmer en antilichaam) en recombinant humaan MIF worden geanalyseerd in NSG-repopulatietesten van onverwerkte normale CD34+-cellen uit navelstrengbloed.

1.6. MIF-remming bij NSG-muizen getransplanteerd met cellen van patiënten in volledige remissie met aanhoudende klonale hematopoëse (DNMT3A / TET2-mutant) Volledige remissiemonsters van zes patiënten met aanhoudende klonale hematopoëse in volledige remissie zullen worden geselecteerd en behandeld zoals in a) om te testen of MIF-remming is ook in staat NSG-herbevolking door resterende preleukemische stamcellen tegen te gaan.

Verwacht wordt dat MIF-remming de ontwikkeling van AML bij muizen zal belemmeren. Stabiliteit en bijwerkingen van anti-MIF-antilichamen of remmers kunnen echter een probleem zijn bij behandelde dieren. In dit geval zullen shRNA's worden gebruikt om MIF in AML-cellen uit te schakelen vóór injectie in NSG-muizen. Een ander probleem kan de noodzaak zijn van co-injectie van MSC's op het moment van xenotransplantatie om de relevantie van het model te vergroten. Indien nodig worden normale MSC's en AML MSC's verzameld, voorbereid en samen met AML-cellen geïnjecteerd.

1.7. Volledige karakterisering van de opwaartse regulatie van MIF in TET2-verarmde cellen Hoe TET2 genregulatie zou kunnen beïnvloeden, blijft nog steeds niet volledig begrepen. Onlangs heeft het team van Cao X aangetoond dat het verlies van Tet2 resulteerde in de opwaartse regulatie van verschillende ontstekingsmediatoren. In dit model rekruteerde Tet2 Hdac2 en onderdrukte transcriptie van Il6 via histondeacetylering. Er is gevonden dat TET2 bindt aan de proximale promotor van het MIF-gen dat is verrijkt met CpG-eilanden in Kasumi-cellen. Verlies van TET2 resulteert in MIF-accumulatie in verschillende leukemische modellen via EGR1. i) MIF-promotermethylering zal worden geanalyseerd door sequentiebepaling na behandeling met bisulfiet in normale CD34+-cellen (20 monsters) en celpopulaties van AML's gesorteerd zoals in c) (150 monsters) ii) EGR1-mRNA-expressie zal worden geanalyseerd door qRT-PCR in normale en AML pre-leukemische stamcellen om te zien of er een correlatie is met MIF-expressie zoals waargenomen in andere modellen iii) ChIP-PCR-analyses gericht op MIF-promoter zullen worden uitgevoerd voor EGR1, H3K4me3, H3K27me3 en HDAC2 in controle- en AML-patiëntmonsters. Als EGR1 niet bij dit systeem is betrokken, zal de MIF-promoterluciferase-assay worden gebruikt om transcriptiefactorplaatsen te identificeren die essentieel zijn voor de opwaartse regulatie ervan in AML-monsters en om de doelen te valideren door middel van ChIP-PCR. Al deze technologieën zijn beschikbaar.

1.8. bidirectionele communicatie tussen MSC's en AML-cellen of normale HSPC's De impact van MIF-overexpressie in AML-cellen zal getest worden op de fysiologie van normale MSC's (differentiatie, instandhouding van hematopoiese, productie van cytokines / chemokines, interactoom). Voor dit doel zullen normale primaire MSC's uit volwassen beenmerg (reeds beschikbaar) worden geïsoleerd en geëxpandeerd zoals beschreven (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). De cellen worden geamplificeerd tot passage 2 (P2). MSC's zullen gedurende 24 en 48 uur worden behandeld met verschillende concentraties recombinant MIF en de proliferatie en productie van cytokines/chemokines zal worden geëvalueerd. Aangezien gemeld is dat MIF de glycolyse stimuleert, zullen de effecten van MIF ook worden ontcijferd in het energetische metabolisme van MSC's door de mitochondriale ademhaling en glycolyse van MSC's te meten (Seahorse XF extracellulaire fluxanalysator) en door hun MIF-geïnduceerde metabole activiteit te bepalen. handtekening met behulp van gemultiplexte vingerafdrukken met hoge doorvoer (Omnilog Biolog). Om de effecten van MIF-overexpressie door AML-cellen te modelleren, zullen co-cultuurexperimenten worden uitgevoerd tussen menselijke primaire AML-cellen (5 monsters) die MIF al dan niet (shRNA) tot expressie brengen. Na 24 en 48 uur zullen MSC's worden gesorteerd en hun proliferatie, celcyclus en differentiatiepotentieel in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten worden geëvalueerd. Eerdere studies geven aan dat MIF-CXCR4 een nieuwe as is voor MSC-recrutering naar tumoren in vivo.

Daarom zal worden onderzocht of recombinant MIF MSC's kan rekruteren met behulp van in vitro transwell-assays. Het effect van MIF-productie door AML-cellen op de werving van MSC's zal worden getest met behulp van AML-geconditioneerd medium. AML-cellen die zijn ontworpen met MIF-shRNA zullen in deze context worden gebruikt. Aangezien het niet kan worden uitgesloten dat MSC's ook kunnen bijdragen aan MIF-productie, zal mRNA-expressie worden getest door primaire normale MSC die samen met AML-cellen zijn gekweekt.

Verwacht wordt dat recombinant MIF een impact zal hebben op proliferatie, celcyclus, differentiatiepotentieel of migratie van MSC's. MIF geproduceerd in BM-micro-omgeving zou echter ook de biologie van andere populaties van de stamcelniche kunnen wijzigen, waaronder osteoblasten, endotheelcellen of macrofagen. Om alternatieve cellen te onderzoeken waarop MIF een impact kan hebben, zal het de effecten op deze populaties testen. MSC's zullen worden geïnduceerd om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten of chondrocyten. MIF zal dan worden toegevoegd om proliferatie, celcyclus en migratie van populaties van belang te onderzoeken. Het effect op osteoblasten en endotheelcellen zal worden gemodelleerd met behulp van respectievelijk MG63- en Huvec-cellijnen.

1.9. Studiepopulatie 1.9.1. Werving van deelnemers 300 volwassen patiënten (>18) die nieuw gediagnosticeerd zijn met AML zullen in het onderzoek worden opgenomen. 85 patiënten die sinds november 2015 in het Saint-Antoine Ziekenhuis zijn gediagnosticeerd, zullen met terugwerkende kracht in de studie worden opgenomen. 215 patiënten die nieuw gediagnosticeerd zijn met AML in de Universitaire Ziekenhuizen van Saint-Antoine en Tours zullen prospectief worden opgenomen [>100 AML-patiënten per jaar worden doorverwezen naar het Saint-Antoine-ziekenhuis (>70 patiënten per jaar) en het Universitair Ziekenhuis van Tours voor AML (>30 patiënten per jaar). jaar)].

1.9.2. Opvolging van deelnemers

Verzameling van patiëntenmonsters:

In het onderzoek zullen alleen standaard bloed- en beenmergmonsters worden gebruikt:

• Bloedmonsters voor biochemie, bloedceltellingen, immunofenotypering, cytogenetica, moleculaire biologische analyses en cryopreservatie van tumorbanken
• Beenmergmonsters voor immunofenotypering, cytogenetica, moleculair biologische analyses en cryopreservatie van tumorbanken

Tijd punten:

Er worden alleen standaardzorgtijdstipmonsters verzameld:

• Diagnosetijdstip (dag 0, Dx-monster)
• Na de eerste chemokuur (C1-tijdstip)
• Na de tweede chemokuur (C2-tijdstip)
• Na de derde chemokuur (C3-tijdstip)

• In geval van terugval of refractairheid,

  • op het moment van diagnose van eerste terugval of refractair (RR1)
  • op het moment van diagnose van tweede terugval of refractairheid (RR2)
• Controlemonsters voor remissie op lange termijn 1, 2, 3 jaar na diagnose (LTR1, 2, 3)