Participación del FOMIN en ALD (MIFAML)

El estudio tiene como objetivo estudiar la participación de MIF en la LMA del adulto.

1. DESCRIPCIÓN DEL ELEMENTO O ELEMENTOS EN INVESTIGACIÓN 1.1. Medición de las concentraciones de MIF Plasma y sobrenadante de MO de pacientes y controles (100 controles emparejados por edad para sangre y plasma de MO, disponibles en Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) será analizado por ELISA. Los sobrenadantes de BM se obtendrán después de un procedimiento de centrifugación de 2 pasos: se centrifugará 1 ml de BM fresca de pacientes con AML o BM de control a 540 g durante 5 min para recuperar células viables en el sedimento (para estudios citométricos y de expresión); el sobrenadante se centrifugará a 1000 g/15 min/4°C para preparar el plasma. Las concentraciones de MIF en MO y plasma sanguíneo se compararán sistemáticamente. Dado que las concentraciones de MIF pueden verse afectadas por diferentes factores, como la inflamación, la leucocitosis y la monocitosis, se medirán los recuentos de células sanguíneas y los niveles de proteína C reactiva en plasma y se tendrán en cuenta en la interpretación de los datos.

1.2. Medición de la expresión de MIF, CD74 y CXCR4 Las células madre hematopoyéticas, las células progenitoras y los blastos de pacientes con LMA se clasificarán según la expresión de los antígenos CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R, teniendo en cuenta el inmunofenotipo inicial de la enfermedad. Las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras de las muestras de BM de control se clasificarán de manera similar. La expresión de ARN de MIF, CD74 y CXCR4 se estudiará mediante RT-PCR cuantitativa en subpoblaciones de células ordenadas. La expresión superficial de CXCR4 y anti-CD74 así como de CD74 intracelular se estudiará mediante flujo multiparamétrico con citometría.

1.3. Análisis de MIF, expresión de CD74, CXCR4 y concentraciones de MIF en el momento de la remisión completa.

Los análisis realizados en a) yb) se repetirán en muestras de remisión completa en 30 a 50 pacientes seleccionados. Los pacientes serán seleccionados de acuerdo a su respuesta a la terapia (evaluación de remisión completa y hemogramas normales) y al genotipo de su enfermedad (15-25 pacientes con mutaciones en TET2 o DNMT3A en el momento del diagnóstico frente a 15-25 pacientes sin estas mutaciones) . Las muestras se recolectarán después de dos ciclos de quimioterapia en el momento de la evaluación de la remisión. Siempre que sea posible, se recopilarán y estudiarán controles de médula ósea de pacientes en remisión a largo plazo (> 1 año después del diagnóstico). Mientras tanto, se utilizarán técnicas de NGS, ddPCR, FISH o RT-PCR para evaluar la persistencia o ausencia de las lesiones iniciales de AML.

Se espera obtener el material completo para el 80% de los pacientes incluidos haciendo alcanzable el objetivo de 240 pacientes en menos de tres años. La purificación celular puede ser un problema en el contexto de la AML con inmunofenotipo aberrante: esto se tendrá en cuenta mediante el uso de protocolos FACS apropiados. Con respecto al enfoque en la vía MIF, no se puede descartar que otras quimiocinas/citocinas u otras moléculas puedan estar involucradas en la comunicación de las células de AML y su microambiente. Por lo tanto, se crioconservarán alícuotas de BM y plasma sanguíneo para permitir un refinamiento de nuestra estrategia (por ejemplo, para realizar análisis de matrices de citoquinas, ELISA o MS que están disponibles en el Hospital Saint-Antoine).

1.4. Modelo de xenotrasplante de AML primaria en ratones NSG Se han desarrollado modelos de xenotrasplante de células AML primarias en una cohorte de 70 AML en las que se analizará la expresión de MIF, el genotipo citogenético y molecular, y se correlacionarán estos parámetros con diferentes fenotipos de injerto.

1.5. Inhibición de MIF en ratones NSG trasplantados con células AML y en ratones NSG trasplantados con HSPC de sangre de cordón sin TET2 o sin DNMT3A Se accederá al papel de MIF en el desarrollo de leucemia en ratones NSG xenotrasplantados con células primarias. En estos experimentos, las células primarias de pacientes con AML de 6 pacientes con mutaciones TET2 de nuestra cohorte que se injertan se utilizarán para generar leucemia. Cuando se observe desarrollo leucémico en sangre (entre 8 y 10 semanas), se medirá la expresión de MIF en el suero de ratones. Los ratones se distribuirán aleatoriamente en tres grupos con 7 ratones por grupo: un grupo será tratado con un inhibidor de MIF disponible comercialmente (ISO-1) y un segundo grupo con un anticuerpo anti MIF y un grupo será tratado con el vehículo durante tres semanas. (una inyección a la semana). A continuación, se controlarán los ratones para detectar el injerto preleucémico y el desarrollo de AML mediante muestras de sangre semanales y tinción con CD45 antihumano.

Se ha desarrollado un modelo de xenotrasplante de células CD34+ de sangre de cordón umbilical transducidas con lentivectores que expresan shRNA TET2. Estas células CD34 positivas diseñadas mostraron una mayor expresión y secreción de MIF y demostraron un injerto de NSG multilinaje mejorado. Se probará si la inhibición de MIF usando inhibidor de MIF o anticuerpo anti MIF conduce a una corrección del injerto de NSG multilinaje mejorado por células sin TET2 en comparación con las células de control. Se realizarán experimentos similares con un modelo agotado de DNMT3A utilizando shRNA de DNMT3A que actualmente están disponibles en el laboratorio. Además, los efectos de la inhibición de MIF (inhibidor y anticuerpo) y MIF humano recombinante se analizarán en ensayos de repoblación NSG de células CD34+ de sangre de cordón umbilical normal sin procesar.

1.6. Inhibición de MIF en ratones NSG trasplantados con células de pacientes en remisión completa con hematopoyesis clonal persistente (mutante DNMT3A/TET2) Se seleccionarán muestras de remisión completa de seis pacientes con hematopoyesis clonal persistente en remisión completa y se tratarán como en a) para probar si la inhibición de MIF también es capaz de contrarrestar la repoblación de NSG por células madre preleucémicas residuales.

Se espera que la inhibición de MIF perjudique el desarrollo de AML en ratones. Sin embargo, la estabilidad y los efectos secundarios de los anticuerpos o inhibidores anti MIF pueden ser un problema en los animales tratados. En este caso, los shRNA se usarán para eliminar el MIF en las células de AML antes de la inyección a los ratones NSG. Otro problema puede ser la necesidad de inyección conjunta de MSC en el momento del xenotrasplante para aumentar la relevancia del modelo. Si es necesario, se recolectarán, prepararán y coinyectarán MSC normales y MSC de AML con células de AML.

1.7. La caracterización completa de la regulación positiva de MIF en células deplecionadas de TET2 Aún no se comprende por completo cómo TET2 podría afectar la regulación génica. Recientemente, el equipo de Cao X ha demostrado que la pérdida de Tet2 resultó en la regulación positiva de varios mediadores inflamatorios. En este modelo, Tet2 reclutó a Hdac2 y reprimió la transcripción de Il6 a través de la desacetilación de histonas. Se ha encontrado que TET2 se une al promotor proximal del gen MIF que está enriquecido en islas CpG en células Kasumi. La pérdida de TET2 da como resultado la acumulación de MIF en varios modelos leucémicos a través de EGR1. i) La metilación del promotor MIF se analizará mediante secuenciación después del tratamiento con bisulfito en células CD34+ normales (20 muestras) y poblaciones celulares de AML clasificadas como en c (150 muestras) ii) La expresión del ARNm de EGR1 se analizará mediante qRT-PCR en células normales y Células madre preleucémicas de AML para ver si existe una correlación con la expresión de MIF como se observa en otros modelos iii) Se realizarán análisis de ChIP-PCR centrados en el promotor de MIF para EGR1, H3K4me3, H3K27me3 y HDAC2 en muestras de pacientes con AML y de control. Si EGR1 no está involucrado en este sistema, se usará el ensayo de luciferasa del promotor MIF para identificar los sitios de factores de transcripción que son esenciales para su regulación positiva en muestras de AML y validar los objetivos mediante ChIP-PCR. Todas estas tecnologías están disponibles.

1.8. comunicación bidireccional entre MSC y células de AML o HSPC normales El impacto de la sobreexpresión de MIF en células de AML se probará en la fisiología de las MSC normales (diferenciación, mantenimiento de la hematopoyesis, producción de citocinas/quimiocinas, interactoma). Para este objetivo, las MSC primarias normales de la médula ósea adulta (ya disponibles) se aislarán y expandirán como se describe (Reinisch A et al, Blood 2015, 125: 249-260). Las Células se amplificarán hasta el paso 2 (P2). Las MSC se tratarán con diferentes concentraciones de MIF recombinante durante 24 y 48 horas y se evaluará la proliferación, producción de citocinas/quimiocinas. Como se ha informado que MIF estimula la glucólisis, los efectos de MIF también se descifrarán en el metabolismo energético de las MSC midiendo la respiración mitocondrial y la glucólisis de las MSC (analizador de flujo extracelular Seahorse XF) y determinando su actividad metabólica inducida por MIF. firma utilizando huellas dactilares multiplexadas de alto rendimiento (Omnilog Biolog). Para modelar los efectos de la sobreexpresión de MIF por parte de las células de AML, se realizarán experimentos de cocultivo entre células de AML primarias humanas (5 muestras) que expresen o no (shRNA) de MIF. Transcurridas 24 y 48 horas, se clasificarán las MSC y se evaluará su potencial de proliferación, ciclo celular y diferenciación en osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Estudios previos indican que MIF-CXCR4 es un eje novedoso para el reclutamiento de MSC en tumores in vivo.

Por lo tanto, se estudiará si MIF recombinante puede reclutar MSC usando ensayos transwell in vitro. El efecto de la producción de MIF por parte de las células de AML en el reclutamiento de MSC se evaluará utilizando un medio acondicionado para AML. En este contexto, se utilizarán células AML diseñadas con MIF shRNA. Como no se puede descartar que las MSC también puedan contribuir a la producción de MIF, la expresión de ARNm se analizará mediante MSC primarias normales cocultivadas con células de AML.

Se espera que el MIF recombinante tenga un impacto sobre la proliferación, el ciclo celular, el potencial de diferenciación o la migración de las MSC. Sin embargo, el MIF producido en el microambiente de BM también podría modificar la biología de otras poblaciones del nicho de células madre, incluidos los osteoblastos, las células endoteliales o los macrófagos. Para investigar células alternativas en las que MIF pueda tener impacto, se probarán sus efectos en estas poblaciones. Se inducirá a las MSC a diferenciarse en osteoblastos, adipocitos o condrocitos. Luego se agregará MIF para investigar la proliferación, el ciclo celular y la migración de las poblaciones de interés. El efecto sobre los osteoblastos y las células endoteliales se modelizará utilizando las líneas celulares MG63 y Huvec, respectivamente.

1.9. Población de estudio 1.9.1. Reclutamiento de participantes Se incluirán en el estudio 300 pacientes adultos (>18) recién diagnosticados con LMA. 85 pacientes diagnosticados desde noviembre de 2015 en el Hospital Saint-Antoine se incluirán retrospectivamente en el estudio. Se incluirán prospectivamente 215 pacientes recién diagnosticados con LMA en los hospitales de la Universidad de Saint-Antoine y Tours [>100 pacientes con LMA por año son derivados al hospital de Saint-Antoine (>70 pacientes por año) y al Hospital Universitario de Tours por LMA (>30 pacientes por año)].

1.9.2. Seguimiento de participantes

Recolección de muestras de pacientes:

En el estudio, solo se utilizarán muestras de sangre y médula ósea de atención estándar:

• Muestras de sangre para bioquímica, hemogramas, inmunofenotipado, citogenética, análisis de biología molecular y criopreservación de bancos de tumores
• Muestras de médula ósea para inmunofenotipado, citogenética, análisis de biología molecular y criopreservación de bancos de tumores

Puntos de tiempo:

Solo se recolectarán muestras de puntos de tiempo de atención estándar:

• Punto de tiempo de diagnóstico (día 0, muestra Dx)
• Después del primer ciclo de quimioterapia (punto temporal C1)
• Después del segundo ciclo de quimioterapia (punto temporal C2)
• Después del tercer ciclo de quimioterapia (punto temporal C3)

• En caso de recidiva o refractariedad,

  • en el momento del diagnóstico de la primera recaída o refractariedad (RR1)
  • en el momento del diagnóstico de segunda recaída o refractariedad (RR2)
• Muestras de control de remisión a largo plazo 1, 2 y 3 años después del diagnóstico (LTR1, 2, 3)