Envolvimento do Fumin na AML (MIFAML)

O estudo visa estudar o envolvimento de MIF na LMA em adultos.

1. DESCRIÇÃO DO ELEMENTO OU ELEMENTOS EM INVESTIGAÇÃO 1.1. Medição das concentrações de MIF Plasma e sobrenadante de BM de pacientes e controles (100 controles pareados por idade para sangue e plasma de BM, disponíveis em Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839 ) serão analisados ​​por ELISA. Os sobrenadantes de BM serão obtidos após um procedimento de centrifugação em 2 etapas: 1 mL de BM fresco de pacientes com LMA ou BM de controle será centrifugado a 540 g por 5 min para recuperar células viáveis ​​no sedimento (para estudos citométricos e de expressão); o sobrenadante será centrifugado a 1000 g/15 min/4°C para preparo do plasma. As concentrações de MIF na MO e no plasma sanguíneo serão sistematicamente comparadas. Como as concentrações de MIF podem ser afetadas por diferentes fatores, incluindo inflamação, leucocitose e monocitose, contagens de células sanguíneas e níveis plasmáticos de proteína C-reativa serão medidos e levados em consideração na interpretação dos dados.

1.2. Medição da expressão de MIF, CD74 e CXCR4 Células-tronco hematopoiéticas, células progenitoras e blastos de pacientes com LMA serão classificados de acordo com a expressão dos antígenos CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R, levando em consideração o imunofenótipo inicial de a doença. Células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras de amostras de BM de controle serão classificadas de forma semelhante. A expressão de RNA de MIF, CD74 e CXCR4 será estudada por RT-PCR quantitativo em subpopulações celulares selecionadas. A expressão superficial de CXCR4 e anti-CD74, bem como CD74 intracelular, serão estudadas por fluxo multiparamétrico com citometria.

1.3. Análise da expressão de MIF, CD74, CXCR4 e concentrações de MIF no momento da remissão completa.

As análises realizadas em a) eb) serão repetidas em amostras de remissão completa em 30 a 50 pacientes selecionados. Os pacientes serão selecionados de acordo com sua resposta à terapia (avaliação de remissão completa e hemograma normal) e o genótipo de sua doença (15-25 pacientes com mutações TET2 ou DNMT3A no momento do diagnóstico vs 15-25 pacientes sem essas mutações) . As amostras serão coletadas após dois ciclos de quimioterapia no momento da avaliação da remissão. Sempre que possível, controles de medula óssea de pacientes em remissão de longo prazo (> 1 ano após o diagnóstico) serão coletados e estudados. Enquanto isso, as técnicas de NGS, ddPCR, FISH ou RT-PCR serão utilizadas para avaliar a persistência ou ausência das lesões iniciais de LMA.

Espera-se que o material completo seja obtido para 80% dos pacientes incluídos, tornando o objetivo de 240 pacientes alcançável em menos de três anos. A purificação celular pode ser um problema no contexto de LMA com imunofenótipo aberrante: isso será levado em consideração pelo uso de protocolos FACS apropriados. Com relação ao foco na via MIF, não se pode descartar que outras quimiocinas/citocinas, ou outras moléculas possam estar envolvidas na comunicação das células AML e seu microambiente. Assim, alíquotas de MO e plasma sanguíneo serão criopreservadas para permitir um refinamento de nossa estratégia (por exemplo, para realizar citocinas, ELISA ou análises de MS que estão disponíveis no Hospital Saint-Antoine).

1.4. Modelo de xenotransplante de AML primária em camundongos NSG Modelos de xenotransplante de células primárias de AML foram desenvolvidos em uma coorte de 70 AMLs em que a expressão de MIF será analisada, o genótipo citogenético e molecular, e correlacionará esses parâmetros com diferentes fenótipos de enxertia.

1.5. Inibição de MIF em camundongos NSG transplantados com células AML e em camundongos NSG transplantados com HSPCs de sangue de cordão com depleção de TET2 ou DNMT3A. O papel do MIF no desenvolvimento de leucemia em camundongos NSG xenotransplantados com células primárias será avaliado. Nesses experimentos, células primárias de pacientes com LMA de 6 pacientes com mutações TET2 de nossa coorte que enxertam serão usadas para gerar leucemia. Quando o desenvolvimento leucêmico for observado no sangue (entre 8 a 10 semanas), a expressão de MIF será medida no soro de camundongos. Os camundongos serão randomizados em três grupos com 7 camundongos por grupo: Um grupo será tratado com um inibidor de MIF comercialmente disponível (ISO-1) e um segundo grupo com um anticorpo anti-MIF e um grupo será tratado pelo veículo por três semanas (uma injeção por semana). Os camundongos serão então monitorados para detectar enxerto pré-leucêmico e desenvolvimento de AML usando amostragem de sangue semanal e coloração de CD45 anti-humano.

Foi desenvolvido um modelo de xenotransplante por células CD34+ de sangue de cordão transduzidas com lentivectors que expressam shRNAs TET2. Essas células CD34 positivas manipuladas mostraram aumento da expressão e secreção de MIF e demonstraram enxerto de NSG multilinhagem aprimorado. Il será testado se a inibição de MIF usando inibidor de MIF ou anticorpo anti-MIF leva a uma correção do enxerto de NSG multilinhagem aprimorado por células TET2-depletadas quando comparadas com células de controle. Experimentos semelhantes serão realizados com um modelo depletado de DNMT3A usando shRNAs de DNMT3A que estão atualmente disponíveis no laboratório. Além disso, os efeitos da inibição do MIF (inibidor e anticorpo) e do MIF humano recombinante serão analisados ​​em ensaios de repopulação NSG de células CD34+ normais não processadas do cordão umbilical.

1.6. Inibição de MIF em camundongos NSG transplantados com células de pacientes em remissão completa com hematopoiese clonal persistente (mutante DNMT3A/TET2) Amostras de remissão completa de seis pacientes com hematopoiese clonal persistente em remissão completa serão selecionadas e tratadas como em a) para testar se há inibição de MIF também é capaz de neutralizar o repovoamento NSG por células-tronco pré-leucêmicas residuais.

Espera-se que a inibição de MIF prejudique o desenvolvimento de AML em camundongos. No entanto, a estabilidade e os efeitos colaterais do anticorpo anti-MIF ou inibidores podem ser um problema em animais tratados. Neste caso, shRNAs serão usados ​​para derrubar MIF em células AML antes da injeção em camundongos NSG. Outra questão pode ser a necessidade de co-injeção de MSCs no momento do xenotransplante para aumentar a relevância do modelo. Se necessário, MSCs normais e AML MSCs serão coletadas, preparadas e co-injetadas com células AML.

1.7. Caracterização completa da regulação positiva de MIF em células depletadas de TET2 Como o TET2 pode afetar a regulação do gene ainda não é completamente compreendido. Recentemente, a equipe de Cao X mostrou que a perda de Tet2 resultou na regulação positiva de vários mediadores inflamatórios. Neste modelo, Tet2 recrutou Hdac2 e reprimiu a transcrição de Il6 via desacetilação de histonas. Verificou-se que TET2 se liga ao promotor proximal do gene MIF que é enriquecido em ilhas CpG em células Kasumi. A perda de TET2 resulta em acúmulo de MIF em vários modelos leucêmicos através de EGR1. i) A metilação do promotor MIF será analisada por sequenciamento após tratamento com bissulfito em células CD34+ normais (20 amostras) e populações celulares de AMLs classificadas como em c)(150 amostras) ii) A expressão de mRNA de EGR1 será analisada por qRT-PCR em normal e Células-tronco pré-leucêmicas AML para ver se há uma correlação com a expressão de MIF conforme observado em outros modelos iii) Análises de ChIP-PCR com foco no promotor MIF serão realizadas para EGR1, H3K4me3, H3K27me3 e HDAC2 em amostras de pacientes de controle e AML. Se EGR1 não estiver envolvido neste sistema, o ensaio de luciferase do promotor MIF será usado para identificar os locais do fator de transcrição que são essenciais para sua regulação positiva em amostras de AML e validar os alvos por ChIP-PCR. Todas essas tecnologias estão disponíveis.

1.8. comunicação bidirecional entre MSCs e células AML ou HSPCs normais O impacto da superexpressão de MIF em células AML será testado na fisiologia de MSCs normais (diferenciação, sustentação da hematopoiese, produção de citocinas/quimiocinas, interactoma). Para tanto, MSCs primárias normais da medula óssea adulta (já disponíveis) serão isoladas e expandidas conforme descrito (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). As Células serão amplificadas até a passagem 2 (P2). As MSCs serão tratadas com diferentes concentrações de MIF recombinante por 24 e 48 horas e será avaliada a proliferação, produção de citocinas/quimiocinas. Como foi relatado que o MIF estimula a glicólise, os efeitos do MIF também serão decifrados no metabolismo energético das MSCs, medindo a respiração mitocondrial e a glicólise das MSCs (analisador de fluxo extracelular Seahorse XF) e determinando seu metabolismo induzido por MIF assinatura usando impressões digitais multiplexadas de alto rendimento (Omnilog Biolog). Para modelar os efeitos da superexpressão de MIF por células AML, serão realizados experimentos de co-cultura entre células AML primárias humanas (5 amostras) que expressam ou não (shRNA) de MIF. Após 24 e 48 horas, as MSCs serão triadas e sua proliferação, ciclo celular e potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos serão avaliados. Estudos anteriores indicam que o MIF-CXCR4 é um novo eixo para o recrutamento de MSC para tumores in vivo.

Assim, será estudado se o MIF recombinante pode recrutar MSCs usando ensaios transwell in vitro. O efeito da produção de MIF por células AML no recrutamento de MSCs será testado usando meio condicionado AML. Células AML engenheiradas com MIF shRNA serão usadas neste contexto. Como não se pode descartar que MSCs também possam contribuir para a produção de MIF, a expressão de mRNA será testada por MSC normais primárias cocultivadas com células AML.

Espera-se que o MIF recombinante tenha um impacto na proliferação, ciclo celular, potencial de diferenciação ou migração de MSCs. No entanto, o MIF produzido no microambiente da BM também pode modificar a biologia de outras populações do nicho de células-tronco, incluindo osteoblastos, células endoteliais ou macrófagos. Para investigar células alternativas nas quais o MIF pode ter impacto, serão testados seus efeitos nessas populações. As MSCs serão induzidas a se diferenciarem em osteoblastos, adipócitos ou condrócitos. O MIF será então adicionado para investigar a proliferação, o ciclo celular e a migração das populações de interesse. O efeito sobre osteoblastos e células endoteliais será modelado usando as linhagens de células MG63 e Huvec, respectivamente.

1.9. População em estudo 1.9.1. Recrutamento de participantes 300 pacientes adultos (>18) recém-diagnosticados com LMA serão incluídos no estudo. Serão incluídos retrospectivamente no estudo 85 pacientes diagnosticados desde novembro de 2015 no Hospital Saint-Antoine. 215 pacientes recentemente diagnosticados com LMA nos hospitais Saint-Antoine e Tours University serão incluídos prospectivamente [>100 pacientes com LMA por ano são encaminhados para o hospital Saint-Antoine (>70 pacientes por ano) e Tours University Hospital para LMA (>30 pacientes por ano)].

1.9.2. Acompanhamento do participante

Coleta de amostra do paciente:

Apenas amostras padrão de sangue e medula óssea serão usadas no estudo:

• Amostras de sangue para bioquímica, contagem de células sanguíneas, imunofenotipagem, citogenética, análises de biologia molecular e criopreservação de bancos de tumores
• Amostras de medula óssea para imunofenotipagem, citogenética, análises de biologia molecular e criopreservação de bancos de tumores

Pontos de tempo:

Apenas amostras de ponto de tempo de atendimento padrão serão coletadas:

• Ponto de tempo de diagnóstico (dia 0, amostra Dx)
• Após o primeiro curso de quimioterapia (ponto de tempo C1)
• Após o segundo curso de quimioterapia (ponto de tempo C2)
• Após o terceiro curso de quimioterapia (ponto de tempo C3)

• Em caso de recidiva ou refratariedade,

  • no momento do diagnóstico da primeira recidiva ou refratariedade (RR1)
  • no momento do diagnóstico da segunda recidiva ou refratariedade (RR2)
• Amostras de controle de remissão de longo prazo em 1, 2, 3 anos após o diagnóstico (LTR1, 2, 3)