MIF 参与反洗钱 (MIFAML)

该研究旨在研究 MIF 在成人 AML 中的参与。

1. 调查中的一个或多个要素的描述 1.1。 MIF 浓度的测量来自患者和对照的血浆和 BM 上清液（100 个年龄匹配的血液和 BM 血浆对照，可在 ClinicalTrials.gov Tours Hospital 获得 #NCT02789839) 将通过 ELISA 进行分析。 BM 上清液将在两步离心程序后获得：来自 AML 患者或对照 BM 的 1 mL 新鲜 BM 将以 540 g 离心 5 分钟以回收沉淀中的活细胞（用于细胞计数和表达研究）；将上清液以 1000 g/15 分钟/4°C 离心以制备血浆。 将系统地比较 BM 和血浆中的 MIF 浓度。 由于 MIF 浓度可能受到不同因素的影响，包括炎症、白细胞增多和单核细胞增多，因此将测量血细胞计数和血浆 C 反应蛋白水平，并在解释数据时将其考虑在内。

1.2. MIF、CD74 和 CXCR4 表达的测量 来自 AML 患者的造血干细胞、祖细胞和原始细胞将根据 CD34、CD38、CD90、CD45-RA、IL-3R 抗原的表达进行分类，同时考虑到 AML 患者的初始免疫表型这种病。 来自对照 BM 样本的造血干细胞和祖细胞将被类似地分类。 MIF、CD74 和 CXCR4 RNA 表达将通过定量 RT-PCR 在分选的细胞亚群中进行研究。 CXCR4 和抗 CD74 的表面表达以及细胞内 CD74 将通过多参数流式细胞术进行研究。

1.3. 完全缓解时 MIF、CD74、CXCR4 表达和 MIF 浓度的分析。

将在 30 至 50 名选定患者的完全缓解样本中重复 a) 和 b) 中进行的分析。 患者将根据他们对治疗的反应（评估完全缓解和正常血细胞计数）以及他们疾病的基因型（15-25 名患者在诊断时具有 TET2 或 DNMT3A 突变与 15-25 名患者没有这些突变）进行选择. 在缓解评估时，将在两个化疗疗程后收集样本。 只要有可能，将收集和研究长期缓解（> 诊断后 1 年）患者的骨髓对照。 同时，NGS、ddPCR、FISH 或 RT-PCR 技术将用于评估初始 AML 病变是否持续存在。

预计将获得 80% 的纳入患者的完整材料，从而在不到三年的时间内实现 240 名患者的目标。 在具有异常免疫表型的 AML 的情况下，细胞纯化可能是一个问题：这将通过使用适当的 FACS 协议来考虑。 对于MIF通路的关注，不能排除其他趋化因子/细胞因子，或其他分子参与AML细胞与其微环境的通讯。 因此，BM 和血浆的等分试样将被冷冻保存，以改进我们的策略（例如，进行细胞因子阵列、ELISA 或 MS 分析，这些可在圣安东尼医院获得）。

1.4. NSG 小鼠中原发性 AML 的异种移植模型 原发性 AML 细胞的异种移植模型已在 70 个 AML 队列中开发，其中将分析 MIF 表达、细胞遗传学和分子基因型，并将这些参数与不同的移植表型相关联。

1.5. 移植了 AML 细胞的 NSG 小鼠和移植了 TET2 耗尽或 DNMT3A 脐带血 HSPC 的 NSG 小鼠中的 MIF 抑制 MIF 对原代细胞异种移植的 NSG 小鼠白血病发展的作用将被访问。 在这些实验中，来自我们队列中 6 名具有 TET2 突变的患者的原代 AML 患者细胞将被移植用于产生白血病。 当血液中出现白血病时（8 至 10 周），将测量小鼠血清中的 MIF 表达。 小鼠将被随机分为三组，每组 7 只小鼠：一组用市售的 MIF 抑制剂 (ISO-1) 治疗，第二组用抗 MIF 抗体治疗，一组用载体治疗三周（每周注射一次）。 然后使用每周血液采样和抗人 CD45 染色监测小鼠以检测白血病前植入和 AML 发展。

已经开发了用表达 TET2 shRNA 的慢病毒转导的脐带血 CD34+ 细胞进行异种移植的模型。 这些经过改造的 CD34 阳性细胞显示出增加的 MIF 表达和分泌，并证明增强的多向 NSG 植入。 将测试与对照细胞相比，使用 MIF 抑制剂或抗 MIF 抗体抑制 MIF 是否会导致 TET2 耗尽细胞对增强的多系 NSG 植入的校正。 类似的实验将使用 DNMT3A 耗尽模型使用实验室目前可用的 DNMT3A shRNA 进行。 此外，将在未处理的正常脐带血 CD34+ 细胞的 NSG 再增殖试验中分析 MIF 抑制（抑制剂和抗体）和重组人 MIF 的影响。

1.6. NSG 小鼠移植有持续性克隆性造血完全缓解患者的细胞（DNMT3A/TET2 突变体）的 MIF 抑制 将选择来自 6 名持续性克隆性造血完全缓解患者的完全缓解样本并按照 a) 中的方法进行处理，以测试 MIF 抑制是否存在也能够通过残留的白血病前干细胞抵消 NSG 再增殖。

预计 MIF 抑制会损害小鼠的 AML 发展。 然而，抗 MIF 抗体或抑制剂的稳定性和副作用可能是治疗动物的一个问题。 在这种情况下，shRNA 将用于在注射到 NSG 小鼠之前敲除 AML 细胞中的 MIF。 另一个问题可能是在异种移植时需要联合注射 MSCs 以增加模型的相关性。 如果需要，将收集、制备正常 MSC 和 AML MSC，并与 AML 细胞共同注射。

1.7. TET2 耗尽细胞中 MIF 上调的完整表征 TET2 如何影响基因调控仍未完全了解。 最近，Cao X 的团队表明，Tet2 的缺失会导致几种炎症介质的上调。 在这个模型中，Tet2 招募 Hdac2 并通过组蛋白去乙酰化抑制 Il6 的转录。 已经发现，TET2 结合了 Kasumi 细胞中富含 CpG 岛的 MIF 基因的近端启动子。 TET2 的缺失导致 MIF 通过 EGR1 在几种白血病模型中积累。 i) 在亚硫酸氢盐处理正常 CD34+ 细胞（20 个样本）和来自 AML 的细胞群（如 c）（150 个样本）中分类后，MIF 启动子甲基化将通过测序进行分析 ii) EGR1 mRNA 表达将通过 qRT-PCR 在正常和AML 前白血病干细胞，看看是否与 MIF 表达相关，如在其他模型中观察到的那样 iii) 将对对照和 AML 患者样本中的 EGR1、H3K4me3、H3K27me3 和 HDAC2 进行以 MIF 启动子为重点的 ChIP-PCR 分析。 如果 EGR1 不参与该系统，MIF 启动子荧光素酶测定将用于识别转录因子位点，这些位点对其在 AML 样本中的上调至关重要，并通过 ChIP-PCR 验证目标。 所有这些技术都可用。

1.8. MSC 与 AML 细胞或正常 HSPC 之间的双向通讯 MIF 在 AML 细胞中过表达的影响将在正常 MSC 的生理学（分化、造血维持、细胞因子/趋化因子的产生、相互作用组）上进行测试。 为此，来自成人骨髓（已经可用）的正常原代 MSC 将按照描述进行分离和扩增（Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260）。 细胞将被扩增至第 2 代 (P2)。 MSC 将用不同浓度的重组 MIF 处理 24 和 48 小时，并评估增殖、细胞因子/趋化因子的产生。 据报道，MIF 会刺激糖酵解，MIF 的作用也将通过测量 MSC 的线粒体呼吸和糖酵解（Seahorse XF 细胞外通量分析仪）并通过确定其 MIF 诱导的代谢来破译 MSC 的能量代谢使用高通量多路复用指纹识别（Omnilog Biolog）的签名。 为了模拟 AML 细胞 MIF 过表达的影响，将在表达或不表达 MIF (shRNA) 的人类原代 AML 细胞（5 个样本）之间进行共培养实验。 24 和 48 小时后，将对 MSCs 进行分选，并评估它们的增殖、细胞周期和分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜能。 以前的研究表明，MIF-CXCR4 是体内 MSC 向肿瘤募集的新轴。

因此，将研究重组 MIF 是否可以使用体外 transwell 测定招募 MSC。 AML 细胞产生 MIF 对 MSCs 募集的影响将使用 AML 条件培养基进行测试。 用 MIF shRNA 改造的 AML 细胞将在这种情况下使用。 由于不能排除 MSC 也可能有助于 MIF 的产生，因此将通过与 AML 细胞共培养的原代正常 MSC 来测试 mRNA 表达。

预计重组 MIF 将对 MSC 的增殖、细胞周期、分化潜能或迁移产生影响。 然而，在 BM 微环境中产生的 MIF 也可以改变干细胞生态位的其他群体的生物学，包括成骨细胞、内皮细胞或巨噬细胞。 为了研究 MIF 可能对其产生影响的替代细胞，将测试其对这些人群的影响。 MSC 将被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞。 然后将添加 MIF 以研究感兴趣的群体的增殖、细胞周期和迁移。 将分别使用 MG63 和 Huvec 细胞系模拟对成骨细胞和内皮细胞的影响。

1.9. 研究人口 1.9.1。 参与者招募 300 名新诊断为 AML 的成年患者 (>18) 将被纳入研究。 自 2015 年 11 月以来在 Saint-Antoine 医院诊断的 85 名患者将被回顾性纳入该研究。 215 名在 Saint-Antoine 和 Tours 大学医院新诊断出患有 AML 的患者将被前瞻性纳入 [每年有超过 100 名 AML 患者被转诊至 Saint-Antoine 医院（每年超过 70 名患者）和 Tours 大学医院接受 AML（每年超过 30 名患者）年）]。

1.9.2.参与者跟进

患者样本采集：

研究中仅使用标准护理血液和骨髓样本：

• 用于生物化学、血细胞计数、免疫分型、细胞遗传学、分子生物学分析和肿瘤库冷冻保存的血液样本
• 用于免疫表型分析、细胞遗传学、分子生物学分析和肿瘤库冷冻保存的骨髓样本

时间点：

仅收集标准护理时间点样本：

• 诊断时间点（第 0 天，Dx 样本）
• 第一疗程化疗后（C1时间点）
• 第二个疗程化疗后（C2时间点）
• 第三个疗程化疗后（C3时间点）

• 在复发或难治性的情况下，

  • 首次复发或难治性诊断时 (RR1)
  • 在诊断第二次复发或难治性 (RR2) 时
• 诊断后 1、2、3 年的长期缓解对照样本（LTR1、2、3）