MIF Zapojení do AML (MIFAML)

Cílem studie je studovat zapojení MIF do AML u dospělých.

1. POPIS PRVKU NEBO PRVKŮ PODLE ZKOUMÁNÍ 1.1. Měření koncentrací MIF Plazma a supernatant BM od pacientů a kontrol (100 věkově odpovídajících kontrol pro krev a BM plazmu, dostupné v nemocnici Tours, ClinicalTrials.gov #NCT02789839) budou analyzovány pomocí ELISA. Supernatanty BM budou získány po 2-krokové centrifugační proceduře: 1 ml čerstvé BM od pacientů s AML nebo kontrolní BM bude centrifugován při 540 g po dobu 5 minut, aby se získaly životaschopné buňky v peletu (pro cytometrické a expresní studie); supernatant bude centrifugován při 1000 g/15 min/4 °C, aby se připravila plazma. Koncentrace MIF v BM a krevní plazmě budou systematicky srovnávány. Protože koncentrace MIF mohou být ovlivněny různými faktory, včetně zánětu, leukocytózy a monocytózy, budou měřeny počty krvinek a hladiny C-reaktivního proteinu v plazmě a zohledněny při interpretaci dat.

1.2. Měření exprese MIF, CD74 a CXCR4 Hematopoetické kmenové buňky, progenitorové buňky a blasty od pacientů s AML budou tříděny podle exprese antigenů CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R s přihlédnutím k výchozímu imunofenotypu nemoc. Hematopoetické kmenové buňky a progenitorové buňky z kontrolních vzorků BM budou tříděny podobně. Exprese MIF, CD74 a CXCR4 RNA bude studována pomocí kvantitativní RT-PCR v subpopulacích tříděných buněk. Povrchová exprese CXCR4 a anti-CD74 i intracelulárního CD74 bude studována multiparametrickým průtokem s cytometrií.

1.3. Analýza exprese MIF, CD74, CXCR4 a koncentrací MIF v době úplné remise.

Analýzy provedené v a) ab) budou opakovány ve vzorcích kompletní remise u 30 až 50 vybraných pacientů. Pacienti budou vybráni podle jejich odpovědi na terapii (hodnocení kompletní remise a normálního krevního obrazu) a genotypu jejich onemocnění (15–25 pacientů s mutací TET2 nebo DNMT3A při diagnóze oproti 15–25 pacientům bez těchto mutací) . Vzorky budou odebrány po dvou chemoterapeutických cyklech v době hodnocení remise. Kdykoli to bude možné, budou odebrány a studovány kontroly kostní dřeně pacientů v dlouhodobé remisi (> 1 rok po diagnóze). Mezitím budou k posouzení perzistence nebo nepřítomnosti počátečních lézí AML použity techniky NGS, ddPCR, FISH nebo RT-PCR.

Očekává se, že kompletní materiál bude získán pro 80 % zahrnutých pacientů, čímž bude cíl 240 pacientů dosažitelný za méně než tři roky. Purifikace buněk může být problémem v souvislosti s AML s aberantním imunofenotypem: toto bude zohledněno použitím vhodných protokolů FACS. Pokud jde o zaměření na dráhu MIF, nelze vyloučit, že se na komunikaci AML buněk a jejich mikroprostředí mohou podílet další chemokiny/cytokiny nebo jiné molekuly. Alikvoty BM a krevní plazmy tedy budou kryokonzervovány, aby bylo možné zpřesnit naši strategii (například provádět cytokinové čipy, ELISA nebo MS analýzy, které jsou dostupné v Saint-Antoine Hospital).

1.4. Xenotransplantační model primární AML u NSG myší Xenotransplantační modely primárních AML buněk byly vyvinuty v kohortě 70 AML, ve kterých bude analyzována exprese MIF, cytogenetický a molekulární genotyp, a korelovat tyto parametry s různými fenotypy přihojení.

1.5. Inhibice MIF u NSG myší s transplantovanými buňkami AML au NSG myší s transplantovanými HSPC pupečníkové krve s ochuzeným TET2 nebo DNMT3A Bude zpřístupněna role MIF na rozvoj leukémie u NSG myší xenotransplantovaných primárními buňkami. V těchto experimentech budou primární buňky pacientů s AML od 6 pacientů s mutacemi TET2 z naší kohorty, které se přihojují, použity k vytvoření leukémie. Když bude leukemický vývoj pozorován v krvi (mezi 8 až 10 týdny), exprese MIF bude měřena v séru myší. Myši budou náhodně rozděleny do tří skupin po 7 myších na skupinu: Jedna skupina bude léčena komerčně dostupným inhibitorem MIF (ISO-1) a druhá skupina protilátkou anti MIF a jedna skupina bude léčena vehikulem po dobu tří týdnů. (jedna injekce týdně). Myši pak budou monitorovány pro detekci pre-leukemického přihojení a rozvoje AML pomocí týdenního odběru krve a barvení proti lidskému CD45.

Byl vyvinut model xenotransplantace CD34+ buňkami pupečníkové krve transdukovanými lentivectory exprimujícími TET2 shRNA. Tyto upravené CD34 pozitivní buňky vykazovaly zvýšenou expresi a sekreci MIF a demonstrovaly zvýšené víceliniové přihojení NSG. Bude testováno, zda inhibice MIF za použití inhibitoru MIF nebo protilátky proti MIF vede ke korekci zesíleného víceliniového přihojení NSG buňkami zbavenými TET2 ve srovnání s kontrolními buňkami. Podobné experimenty budou provedeny s modelem ochuzeným o DNMT3A s použitím DNMT3A shRNA, které jsou v současnosti dostupné v laboratoři. Kromě toho budou účinky inhibice MIF (inhibitor a protilátka) a rekombinantního lidského MIF analyzovány v NSG repopulačních testech nezpracovaných normálních CD34+ buněk z pupečníkové krve.

1.6. Inhibice MIF u myší NSG transplantovaných buňkami od pacientů v kompletní remisi s přetrvávající klonální hematopoézou (mutant DNMT3A / TET2) Vzorky kompletní remise od šesti pacientů s perzistentní klonální hematopoézou v kompletní remisi budou vybrány a ošetřeny jako v a) za účelem testování, zda inhibice MIF je také schopen působit proti repopulaci NSG reziduálními preleukemickými kmenovými buňkami.

Očekává se, že inhibice MIF naruší vývoj AML u myší. Avšak stabilita a vedlejší účinky anti MIF protilátky nebo inhibitorů mohou být problémem u léčených zvířat. V tomto případě budou shRNA použity ke snížení MIF v AML buňkách před injekcí do NSG myší. Dalším problémem může být potřeba společné injekce MSC v době xenotransplantace, aby se zvýšila relevance modelu. V případě potřeby budou normální MSC a AML MSC odebrány, připraveny a společně injikovány s AML buňkami.

1.7. Úplná charakterizace up-regulace MIF v buňkách ochuzených o TET2 Jak může TET2 ovlivnit genovou regulaci, stále není zcela objasněno. Nedávno tým Cao X ukázal, že ztráta Tet2 vedla k upregulaci několika zánětlivých mediátorů. V tomto modelu Tet2 rekrutoval Hdac2 a potlačil transkripci IL6 prostřednictvím deacetylace histonů. Bylo zjištěno, že TET2 se váže na proximální promotor genu MIF, který je obohacen o ostrůvky CpG v buňkách Kasumi. Ztráta TET2 vede k akumulaci MIF v několika leukemických modelech prostřednictvím EGR1. i) Methylace promotoru MIF bude analyzována sekvenováním po bisulfitovém ošetření v normálních CD34+ buňkách (20 vzorků) a buněčných populacích z AML tříděných jako v c) (150 vzorků) ii) Exprese EGR1 mRNA bude analyzována pomocí qRT-PCR v normálních a AML preleukemické kmenové buňky, aby se zjistilo, zda existuje korelace s expresí MIF, jak bylo pozorováno v jiných modelech. iii) Analýza ChIP-PCR se zaměřením na promotor MIF bude provedena pro EGR1, H3K4me3, H3K27me3 a HDAC2 v kontrolních vzorcích a vzorcích pacientů s AML. Pokud EGR1 není zapojen do tohoto systému, použije se luciferázový test MIF promotoru k identifikaci míst transkripčního faktoru, která jsou nezbytná pro jeho up-regulaci ve vzorcích AML a validaci cílů pomocí ChIP-PCR. Všechny tyto technologie jsou dostupné.

1.8. obousměrná komunikace mezi MSC a AML buňkami nebo normálními HSPC Vliv nadměrné exprese MIF v AML buňkách bude testován na fyziologii normálních MSC (diferenciace, udržení hematopoézy, produkce cytokinů/chemokinů, interaktom). Za tímto účelem budou normální primární MSC z dospělé kostní dřeně (již dostupné) izolovány a expandovány, jak je popsáno (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). Buňky budou amplifikovány až do pasáže 2 (P2). MSC budou ošetřeny různými koncentracemi rekombinantního MIF po dobu 24 a 48 hodin a bude hodnocena proliferace, produkce cytokinů/chemokinů. Jak bylo hlášeno, že MIF stimuluje glykolýzu, účinky MIF budou také dešifrovány v energetickém metabolismu MSC měřením mitochondriální respirace a glykolýzy MSC (analyzátor extracelulárního toku Seahorse XF) a stanovením jejich MIF-indukovaného metabolického podpis pomocí vysoce výkonného multiplexního otisku prstů (Omnilog Biolog). Pro modelování účinků nadměrné exprese MIF buňkami AML budou provedeny experimenty společné kultury mezi lidskými primárními buňkami AML (5 vzorků), které exprimují nebo neexprimují (shRNA) MIF. Po 24 a 48 hodinách budou MSC roztříděny a bude hodnocena jejich proliferace, buněčný cyklus a diferenciační potenciál na osteoblasty, adipocyty a chondrocyty. Předchozí studie naznačují, že MIF-CXCR4 je nová osa pro nábor MSC do nádorů in vivo.

Bude tedy studováno, zda rekombinantní MIF může získávat MSC pomocí in vitro transwell testů. Účinek produkce MIF buňkami AML na nábor MSC bude testován pomocí AML kondicionovaného média. V tomto kontextu budou použity AML buňky upravené pomocí MIF shRNA. Protože nelze vyloučit, že MSC mohou také přispívat k produkci MIF, bude exprese mRNA testována primárními normálními MSC společně kultivovanými s buňkami AML.

Očekává se, že rekombinantní MIF bude mít dopad buď na proliferaci, buněčný cyklus, diferenciační potenciál nebo migraci MSC. MIF produkovaný v mikroprostředí BM by však mohl také modifikovat biologii jiných populací niky kmenových buněk včetně osteoblastů, endoteliálních buněk nebo makrofágů. Za účelem prozkoumání alternativních buněk, na které může mít MIF dopad, budou testovány jeho účinky na tyto populace. MSC budou indukovány k diferenciaci na osteoblasty, adipocyty nebo chondrocyty. Poté bude přidán MIF, aby se prozkoumala proliferace, buněčný cyklus a migrace sledovaných populací. Účinek na osteoblasty a endoteliální buňky bude modelován pomocí buněčných linií MG63 a Huvec.

1.9. Studijní populace 1.9.1. Nábor účastníků Do studie bude zahrnuto 300 dospělých pacientů (>18) nově diagnostikovaných s AML. Do studie bude retrospektivně zahrnuto 85 pacientů diagnostikovaných od listopadu 2015 v nemocnici Saint-Antoine. 215 pacientů nově diagnostikovaných s AML v univerzitních nemocnicích Saint-Antoine a Tours bude prospektivně zahrnuto [>100 pacientů s AML ročně je odesláno do nemocnice Saint-Antoine (>70 pacientů ročně) a do Tours University Hospital pro AML (>30 pacientů na rok rok)].

1.9.2. Sledování účastníků

Odběr vzorků pacientů:

Ve studii budou použity pouze vzorky krve a kostní dřeně standardní péče:

• Vzorky krve pro biochemii, počty krvinek, imunofenotypizaci, cytogenetiku, molekulárně biologické analýzy a kryokonzervaci nádorových bank
• Vzorky kostní dřeně pro imunofenotypizaci, cytogenetiku, molekulárně biologické analýzy a kryokonzervaci nádorové banky

Časové body:

Budou odebrány pouze vzorky standardních časových bodů péče:

• Časový bod diagnózy (den 0, vzorek Dx)
• Po prvním cyklu chemoterapie (časový bod C1)
• Po druhém cyklu chemoterapie (časový bod C2)
• Po třetím cyklu chemoterapie (časový bod C3)

• V případě relapsu nebo refrakternosti,

  • v době diagnózy prvního relapsu nebo refrakternosti (RR1)
  • v době diagnózy druhého relapsu nebo refrakternosti (RR2)
• Kontrolní vzorky dlouhodobé remise 1, 2, 3 roky po diagnóze (LTR1, 2, 3)