AML에 MIF 관여 (MIFAML)

이 연구는 성인 AML에서 MIF의 관여를 연구하는 것을 목표로 합니다.

1. 조사 대상 요소에 대한 설명 1.1. MIF 농도 측정 환자 및 대조군의 혈장 및 BM 상청액(혈액 및 BM 혈장에 대한 100개의 연령 일치 대조군, Tours Hospital, ClinicalTrials.gov에서 이용 가능) #NCT02789839 )는 ELISA에서 분석합니다. BM 상청액은 2단계 원심분리 절차 후에 얻을 수 있습니다: AML 환자 또는 대조군 BM의 신선한 BM 1mL를 540g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿에서 생존 가능한 세포를 회수합니다(세포계수 및 발현 연구용). 상청액은 혈장을 준비하기 위해 1000g/15분/4°C에서 원심분리됩니다. BM 및 혈장의 MIF 농도를 체계적으로 비교합니다. MIF 농도는 염증, 백혈구증가증, 단핵구증가증을 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있으므로 혈구 수와 혈장 C 반응성 단백질 수치가 측정되고 데이터 해석에 고려됩니다.

1.2. MIF, CD74 및 CXCR4 발현 측정 AML 환자의 조혈 줄기 세포, 전구 세포 및 모세포는 초기 면역 표현형을 고려하여 CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R 항원의 발현에 따라 분류됩니다. 질병. 대조군 BM 샘플의 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 유사하게 분류됩니다. MIF, CD74 및 CXCR4 RNA 발현은 분류된 세포 소집단에서 정량적 RT-PCR에 의해 연구될 것입니다. 세포내 CD74뿐만 아니라 CXCR4 및 항-CD74의 표면 발현은 세포계산을 통한 다중 매개변수 흐름에 의해 연구될 것입니다.

1.3. 완전 관해 시 MIF, CD74, CXCR4 발현 및 MIF 농도 분석.

a) 및 b)에서 수행된 분석은 30 내지 50명의 선택된 환자의 완전 관해 샘플에서 반복될 것이다. 환자는 치료에 대한 반응(완전 관해 및 정상 혈구 수 평가) 및 질병의 유전자형(진단 시 TET2 또는 DNMT3A 돌연변이가 있는 15-25명의 환자 대 이러한 돌연변이가 없는 15-25명의 환자)에 따라 선택됩니다. . 관해 평가 시점에 2회의 화학요법 과정 후에 샘플을 수집할 것입니다. 가능할 때마다 장기 관해(진단 후 > 1년) 환자의 골수 대조군을 수집하고 연구할 것입니다. 그 동안 NGS, ddPCR, FISH 또는 RT-PCR 기술을 사용하여 초기 AML 병변의 지속 여부를 평가합니다.

포함된 환자의 80%에 대해 완전한 자료를 확보하여 3년 이내에 240명의 환자 목표를 달성할 것으로 예상됩니다. 비정상적인 면역 표현형이 있는 AML과 관련하여 세포 정제가 문제가 될 수 있습니다. 적절한 FACS 프로토콜을 사용하여 이를 고려할 것입니다. MIF 경로에 대한 초점과 관련하여 다른 케모카인/사이토카인 또는 다른 분자가 AML 세포 및 미세 환경의 통신에 관여할 수 있음을 배제할 수 없습니다. 따라서, BM 및 혈장의 분취량은 당사의 전략을 개선할 수 있도록 동결 보존될 것입니다(예: Saint-Antoine 병원에서 이용 가능한 사이토카인 어레이, ELISA 또는 MS 분석 수행).

1.4. NSG 마우스에서 원발성 AML의 이종이식 모델 원발성 AML 세포의 이종이식 모델은 MIF 발현, 세포유전학적 및 분자 유전자형을 분석할 70개의 AML 코호트에서 개발되었으며, 이들 매개변수를 상이한 이식 표현형에 연관시킵니다.

1.5. AML 세포가 이식된 NSG 마우스 및 TET2-고갈 또는 DNMT3A-고갈 제대혈 HSPC가 이식된 NSG 마우스에서 MIF 억제 1차 세포로 이종이식된 NSG 마우스에서 백혈병 발생에 대한 MIF의 역할에 접근할 것이다. 이 실험에서, 우리 코호트의 TET2 돌연변이를 가진 6명의 환자로부터 얻은 1차 AML 환자 세포는 백혈병을 일으키는 데 사용될 것입니다. 백혈병 발달이 혈액에서 보일 때(8주에서 10주 사이), MIF 발현은 마우스의 혈청에서 측정될 것입니다. 마우스는 그룹당 7마리씩 세 그룹으로 무작위 배정됩니다. 한 그룹은 상업적으로 이용 가능한 MIF 억제제(ISO-1)로, 두 번째 그룹은 항 MIF 항체로 치료하고, 한 그룹은 3주 동안 비히클로 치료합니다. (주 1회 주사). 그런 다음 매주 혈액 샘플링 및 항 인간 CD45 염색을 사용하여 백혈병 전 생착 및 AML 발달을 감지하기 위해 마우스를 모니터링합니다.

TET2 shRNA를 발현하는 렌티벡터로 형질도입된 제대혈 CD34+ 세포에 의한 이종이식 모델이 개발되었습니다. 이들 조작된 CD34 양성 세포는 증가된 MIF 발현 및 분비를 나타내었고 향상된 다계통 NSG 생착을 입증하였다. II는 대조군 세포와 비교할 때 MIF 억제제 또는 항 MIF 항체를 사용한 MIF의 억제가 TET2-고갈된 세포에 의한 강화된 다계열 NSG 생착의 교정을 유도하는지 여부를 시험할 것이다. 현재 실험실에서 사용 가능한 DNMT3A shRNA를 사용하여 DNMT3A 고갈 모델로 유사한 실험을 수행할 것입니다. 또한, MIF 억제(억제제 및 항체) 및 재조합 인간 MIF의 효과는 처리되지 않은 정상 제대혈 CD34+ 세포의 NSG 재증식 분석에서 분석될 것입니다.

1.6. 지속적 클론성 조혈(DNMT3A/TET2 돌연변이)을 동반한 완전 관해 상태의 환자로부터의 세포를 이식한 NSG 마우스에서의 MIF 억제 완전 관해 상태에서 지속성 클론성 조혈을 갖는 6명의 환자로부터의 완전 관해 샘플을 선택하고 a)에서와 같이 처리하여 MIF 억제 여부를 시험한다. 또한 잔류 전 백혈병 줄기 세포에 의한 NSG 재증식에 대응할 수 있습니다.

MIF 억제는 마우스에서 AML 발달을 손상시킬 것으로 예상됩니다. 그러나 항 MIF 항체 또는 억제제의 안정성 및 부작용은 처리된 동물에서 문제가 될 수 있습니다. 이 경우 shRNA는 NSG 마우스에 주입하기 전에 AML 세포에서 MIF를 녹다운하는 데 사용됩니다. 또 다른 문제는 모델의 관련성을 높이기 위해 이종이식 시 MSC를 공동 주입해야 할 필요성일 수 있습니다. 필요한 경우 정상 MSC 및 AML MSC를 수집, 준비 및 AML 세포와 함께 주입합니다.

1.7. TET2가 고갈된 세포에서 MIF의 상향 조절의 전체 특성 규명 TET2가 유전자 조절에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지는 여전히 완전히 이해되지 않고 있습니다. 최근 Cao X의 팀은 Tet2의 손실이 여러 염증 매개체의 상향 조절을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 이 모델에서 Tet2는 Hdac2를 모집하고 히스톤 탈아세틸화를 통해 Il6의 전사를 억제했습니다. TET2는 Kasumi 세포에서 CpG 섬이 풍부한 MIF 유전자의 근위 프로모터에 결합하는 것으로 밝혀졌습니다. TET2의 손실은 EGR1을 통해 여러 백혈병 모델에서 MIF 축적을 초래합니다. i) MIF 프로모터 메틸화는 정상 CD34+ 세포(20개 샘플) 및 c)(150개 샘플)에서와 같이 분류된 AML로부터의 세포 집단에서 바이설파이트 처리 후 시퀀싱에 의해 분석될 것이다. ii) EGR1 mRNA 발현은 정상 및 다른 모델에서 관찰된 MIF 발현과 상관관계가 있는지 확인하기 위한 AML 전백혈병 줄기 세포 iii) MIF 프로모터에 초점을 맞춘 ChIP-PCR 분석은 대조군 및 AML 환자 샘플에서 EGR1, H3K4me3, H3K27me3 및 HDAC2에 대해 수행됩니다. EGR1이 이 시스템에 관여하지 않는 경우 MIF 프로모터 루시퍼라제 분석을 사용하여 AML 샘플에서 상향 조절에 필수적인 전사 인자 부위를 식별하고 ChIP-PCR로 표적을 검증합니다. 이러한 모든 기술을 사용할 수 있습니다.

1.8. MSC와 AML 세포 또는 정상 HSPC 사이의 양방향 통신 AML 세포에서 MIF 과발현의 영향을 정상 MSC의 생리학(분화, 조혈 지속, 사이토카인/케모카인 생산, 상호작용)에 대해 테스트할 것입니다. 이 목적을 위해 성인 골수(이미 이용 가능)의 정상 1차 중간엽 줄기세포를 분리하고 설명된 대로 확장합니다(Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). 세포는 계대 2(P2)까지 증폭됩니다. 중간엽 줄기세포는 24시간 및 48시간 동안 상이한 농도의 재조합 MIF로 처리될 것이며 사이토카인/케모카인의 증식, 생산이 평가될 것입니다. MIF가 해당작용을 자극한다고 보고되었으므로 MIF의 효과는 중간엽 줄기세포의 미토콘드리아 호흡 및 해당작용(Seahorse XF 세포외 플럭스 분석기)을 측정하고 MIF 유도 대사를 결정함으로써 MSC의 에너지 대사에서도 해독될 것입니다. 높은 처리량의 다중 지문(Omnilog Biolog)을 사용한 서명. AML 세포에 의한 MIF 과발현의 효과를 모델링하기 위해, MIF의 shRNA를 발현하는지 여부(shRNA)를 나타내는 인간 1차 AML 세포(5개 샘플) 사이의 공동 배양 실험을 수행할 것이다. 24시간 및 48시간 후에 중간엽 줄기세포를 분류하고 이들의 증식, 세포 주기 및 조골세포, 지방세포 및 연골세포로의 분화 가능성을 평가합니다. 이전 연구에서는 MIF-CXCR4가 생체 내에서 종양에 MSC 모집을 위한 새로운 축임을 나타냅니다.

따라서 재조합 MIF가 시험관 내 트랜스웰 분석을 사용하여 MSC를 모집할 수 있는지 여부를 연구할 것입니다. 중간엽 줄기세포 모집에 대한 AML 세포에 의한 MIF 생산의 효과는 AML 조절 배지를 사용하여 테스트할 것입니다. MIF shRNA로 조작된 AML 세포가 이 맥락에서 사용될 것입니다. MSC가 MIF 생산에도 기여할 수 있다는 것을 배제할 수 없기 때문에 mRNA 발현은 AML 세포와 함께 배양된 1차 정상 MSC에 의해 테스트될 것입니다.

재조합 MIF는 MSC의 증식, 세포 주기, 분화 가능성 또는 이동에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 그러나, BM 미세환경에서 생성된 MIF는 조골세포, 내피 세포 또는 대식세포를 포함하는 줄기 세포 적소의 다른 집단의 생물학을 수정할 수도 있습니다. MIF가 영향을 미칠 수 있는 대체 세포를 조사하기 위해 이러한 집단에 미치는 영향을 테스트할 것입니다. MSC는 조골세포, 지방세포 또는 연골세포로 분화하도록 유도될 것입니다. 그런 다음 MIF를 추가하여 관심 대상 집단의 증식, 세포 주기 및 이동을 조사합니다. 골아세포 및 내피 세포에 대한 효과는 각각 MG63 및 Huvec 세포주를 사용하여 모델링됩니다.

1.9. 연구 인구 1.9.1. 참가자 모집 새로 AML로 진단된 300명의 성인 환자(>18)가 연구에 포함될 것입니다. 2015년 11월 이후 Saint-Antoine 병원에서 진단받은 85명의 환자를 후향적으로 연구에 포함할 예정입니다. Saint-Antoine 및 Tours University 병원에서 AML로 새로 진단된 215명의 환자가 전향적으로 포함됩니다. 년도)].

1.9.2. 참가자 후속 조치

환자 샘플 수집:

표준 관리 혈액 및 골수 샘플만 연구에 사용됩니다.

• 생화학, 혈구 수, 면역 표현형 분석, 세포 유전학, 분자 생물학 분석 및 종양 은행 동결 보존을 위한 혈액 샘플
• 면역 표현형 분석, 세포 유전학, 분자 생물학 분석 및 종양 은행 동결 보존을 위한 골수 샘플

시점:

표준 관리 시점 샘플만 수집됩니다.

• 진단 시점(0일, Dx 샘플)
• 첫 번째 화학 요법 과정 후(C1 시점)
• 두 번째 화학 요법 과정 후(C2 시점)
• 3차 화학요법 후(C3 시점)

• 재발 또는 불응의 경우,

  • 첫 번째 재발 또는 불응성 진단 시(RR1)
  • 두 번째 재발 또는 불응성 진단 시(RR2)
• 진단 후 1년, 2년, 3년차 장기 관해 대조군 샘플(LTR1, 2, 3)