MIF-engasjement i AML (MIFAML)

Studien tar sikte på å studere involvering av MIF i voksen AML.

1. BESKRIVELSE AV ELEMENTET ELLER ELEMENTER UNDER UNDERSØKELSE 1.1. Måling av MIF-konsentrasjoner Plasma- og BM-supernatant fra pasienter og kontroller (100 alderstilpassede kontroller for blod og BM-plasma, tilgjengelig på Tours Hospital, ClinicalTrials.gov #NCT02789839) vil bli analysert med ELISA. BM-supernatanter vil bli oppnådd etter en 2-trinns sentrifugeringsprosedyre: 1 mL fersk BM fra AML-pasienter eller kontroll-BM vil bli sentrifugert ved 540 g i 5 minutter for å gjenvinne levedyktige celler i pelleten (for cytometriske og ekspresjonsstudier); supernatanten vil bli sentrifugert ved 1000 g/15 min/4°C for å forberede plasmaet. MIF-konsentrasjoner i BM og blodplasma vil bli systematisk sammenlignet. Siden MIF-konsentrasjoner kan påvirkes av forskjellige faktorer, inkludert betennelse, leukocytose og monocytose, vil blodcelletall og plasma C-reaktive proteinnivåer bli målt og tatt i betraktning i tolkningen av dataene.

1.2. Måling av MIF-, CD74- og CXCR4-ekspresjon Hematopoietiske stamceller, progenitorceller og blaster fra AML-pasienter vil bli sortert i henhold til ekspresjonen av CD34, CD38, CD90, CD45-RA, IL-3R antigener, tatt i betraktning den initiale immunfenotypen av sykdommen. Hematopoietiske stamceller og stamceller fra kontroll-BM-prøver vil bli sortert på samme måte. MIF, CD74 og CXCR4 RNA-ekspresjon vil bli studert ved kvantitativ RT-PCR i sorterte cellesubpopulasjoner. Overflateekspresjonen av CXCR4 og anti-CD74 samt intracellulær CD74 vil bli studert ved multiparametrisk flyt med cytometri.

1.3. Analyse av MIF, CD74, CXCR4 ekspresjon og MIF konsentrasjoner på tidspunktet for fullstendig remisjon.

Analysene utført i a) og b) vil bli gjentatt i komplette remisjonsprøver hos 30 til 50 utvalgte pasienter. Pasienter vil bli valgt i henhold til deres respons på terapi (vurdering av fullstendig remisjon og normal blodtelling), og til genotypen av sykdommen deres (15-25 pasienter med enten TET2- eller DNMT3A-mutasjoner ved diagnose kontra 15-25 pasienter uten disse mutasjonene) . Prøver vil bli samlet inn etter to kjemoterapikurs på tidspunktet for remisjonsevaluering. Når det er mulig, vil benmargskontroller av pasienter i langtidsremisjon (> 1 år etter diagnose) samles inn og studeres. I mellomtiden vil NGS-, ddPCR-, FISH- eller RT-PCR-teknikker bli brukt for å vurdere persistensen eller fraværet av de første AML-lesjonene.

Det forventes at fullstendig materiale vil bli innhentet for 80 % av inkluderte pasienter, noe som gjør målet om 240 pasienter oppnåelig på mindre enn tre år. Cellerensing kan være et problem i sammenheng med AML med avvikende immunfenotype: dette vil bli tatt i betraktning ved bruk av passende FACS-protokoller. Når det gjelder fokus på MIF-vei, kan det ikke utelukke at andre kjemokiner/cytokiner, eller andre molekyler kan være involvert i kommunikasjonen av AML-celler og deres mikromiljø. Således vil alikvoter av BM og blodplasma kryokonserveres for å tillate en forfining av strategien vår (for eksempel å utføre cytokinarrayer, ELISA eller MS-analyser som er tilgjengelige ved Saint-Antoine Hospital).

1.4. Xenotransplantasjonsmodell av primær AML i NSG-mus Xenotransplantasjonsmodeller av primære AML-celler er utviklet i en kohort på 70 AMLer der MIF-ekspresjon vil bli analysert, den cytogenetiske og molekylære genotypen, og korrelere disse parametrene til forskjellige enpodefenotyper.

1.5. MIF-hemming i NSG-mus transplantert med AML-celler og i NSG-mus transplantert med TET2-utarmet eller DNMT3A-utarmet navlestrengsblod-HSPC. Rollen til MIF på utvikling av leukemi i NSG-mus xenotransplantert med primære celler vil bli tilgjengelig. I disse eksperimentene vil primære AML-pasientceller fra 6 pasienter med TET2-mutasjoner av vår kohort som engrafterer bli brukt til å generere leukemi. Når leukemiutvikling vil bli sett i blod (mellom 8 til 10 uker), vil MIF-ekspresjon bli målt i serumet til mus. Mus vil bli randomisert inn i tre grupper med 7 mus per gruppe: En gruppe vil bli behandlet med en kommersielt tilgjengelig MIF-hemmer (ISO-1) og en andre gruppe med et anti-MIF-antistoff og en gruppe vil bli behandlet av bæreren i tre uker (en injeksjon i uken). Mus vil deretter bli overvåket for å oppdage pre-leukemisk engraftment og AML-utvikling ved bruk av ukentlig blodprøvetaking og anti-human CD45-farging.

En modell for xenotransplantasjon av CD34+-celler fra navlestrengsblod transdusert med lentivectors som uttrykker TET2 shRNA-er er utviklet. Disse konstruerte CD34-positive cellene viste økt MIF-ekspresjon og sekresjon og demonstrerte forbedret multilineage NSG-engraftment. Il vil bli testet om inhibering av MIF ved bruk av MIF-hemmer eller anti-MIF-antistoff fører til en korreksjon av den forbedrede multilineage NSG-engraftment av TET2-utarmede celler sammenlignet med kontrollceller. Lignende eksperimenter vil bli utført med en DNMT3A-utarmet modell ved bruk av DNMT3A shRNA som for tiden er tilgjengelig i laboratoriet. I tillegg vil effekten av MIF-hemming (inhibitor og antistoff) og rekombinant human MIF bli analysert i NSG-repopulasjonsanalyser av ubehandlede normale CD34+-celler fra navlestrengsblod.

1.6. MIF-hemming hos NSG-mus transplantert med celler fra pasienter i fullstendig remisjon med vedvarende klonal hematopoiesis (DNMT3A / TET2 mutant) Komplette remisjonsprøver fra seks pasienter med vedvarende klonal hematopoiesis i fullstendig remisjon vil bli valgt og behandlet som i a) for å teste om MIF-hemming er også i stand til å motvirke NSG-repopulasjon av gjenværende pre-leukemiske stamceller.

Det forventes at MIF-hemming vil svekke AML-utvikling hos mus. Imidlertid kan stabilitet og bivirkninger av anti-MIF-antistoffer eller -hemmere være et problem hos behandlede dyr. I dette tilfellet vil shRNA-er bli brukt til å slå ned MIF i AML-celler før injeksjon til NSG-mus. Et annet problem kan være behovet for samtidig injeksjon av MSC-er på tidspunktet for xenotransplantasjon for å øke modellens relevans. Om nødvendig vil vanlige MSC-er og AML-MSC-er samles inn, klargjøres og injiseres sammen med AML-celler.

1.7. Full karakterisering av oppreguleringen av MIF i TET2-utarmede celler Hvordan TET2 kan påvirke genregulering er fortsatt ikke fullstendig forstått. Nylig har teamet til Cao X vist at tap av Tet2 resulterte i oppregulering av flere inflammatoriske mediatorer. I denne modellen rekrutterte Tet2 Hdac2 og undertrykte transkripsjon av Il6 via histondeacetylering. Det er funnet at TET2 binder den proksimale promoteren til MIF-genet som er anriket på CpG-øyer i Kasumi-celler. Tap av TET2 resulterer i MIF-akkumulering i flere leukemimodeller gjennom EGR1. i) MIF-promoter-metylering vil bli analysert ved sekvensering etter bisulfittbehandling i normale CD34+-celler (20 prøver) og cellepopulasjoner fra AML-er sortert som i c)(150 prøver) ii) EGR1-mRNA-ekspresjon vil bli analysert med qRT-PCR i normal og AML pre-leukemiske stamceller for å se om det er en korrelasjon med MIF-ekspresjon som observert i andre modeller iii) ChIP-PCR-analyser med fokus på MIF-promoter vil bli utført for EGR1, H3K4me3, H3K27me3 og HDAC2 i kontroll- og AML-pasientprøver. Hvis EGR1 ikke er involvert i dette systemet, vil MIF-promoter luciferase-analysen bli brukt til å identifisere transkripsjonsfaktorsteder som er essensielle for dets oppregulering i AML-prøver og validere målene ved ChIP-PCR. Alle disse teknologiene er tilgjengelige.

1.8. toveis kommunikasjon mellom MSC-er og AML-celler eller normale HSPC-er Effekten av MIF-overuttrykk i AML-celler vil bli testet på fysiologien til normale MSC-er (differensiering, opprettholdelse av hematopoiesis, produksjon av cytokiner/kjemokiner, interaktom). For dette formålet vil normale primære MSC-er fra voksen benmarg (allerede tilgjengelig) bli isolert og utvidet som beskrevet (Reinisch A et al, Blood 2015, 125:249-260). Cellene vil bli forsterket opp til passasje 2 (P2). MSC-er vil bli behandlet med forskjellige konsentrasjoner av rekombinant MIF i 24 og 48 timer, og proliferasjonen, produksjonen av cytokiner/kjemokiner vil bli evaluert. Siden det har blitt rapportert at MIF stimulerer glykolyse, vil effekten av MIF også dechiffreres i den energiske metabolismen til MSCs ved å måle mitokondriell respirasjon og glykolyse av MSCs (Seahorse XF ekstracellulær fluksanalysator) og ved å bestemme deres MIF-induserte metabolske signatur ved bruk av multiplekset fingeravtrykk med høy gjennomstrømning (Omnilog Biolog). For å modellere effektene av MIF-overuttrykk av AML-celler, vil utføre samkultureksperimenter mellom humane primære AML-celler (5 prøver) som uttrykker eller ikke (shRNA) av MIF. Etter 24 og 48 timer vil MSC-er sorteres og deres spredning, cellesyklus og differensieringspotensial til osteoblaster, adipocytter og kondrocytter vil bli evaluert. Tidligere studier indikerer at MIF-CXCR4 er en ny akse for MSC-rekruttering til svulster in vivo.

Det vil derfor bli studert om rekombinant MIF kan rekruttere MSCs ved bruk av in vitro transwell-analyser. Effekten av MIF-produksjon av AML-celler på MSCs rekruttering vil bli testet ved bruk av AML-kondisjonert medium. AML-celler konstruert med MIF shRNA vil bli brukt i denne sammenhengen. Siden det ikke kan utelukke at MSC-er også kan bidra til MIF-produksjon, vil mRNA-ekspresjon bli testet av primær normal MSC dyrket sammen med AML-celler.

Det forventes at rekombinant MIF vil ha innvirkning på enten proliferasjon, cellesyklus, differensieringspotensial eller migrering av MSC-er. Imidlertid kan MIF produsert i BM-mikromiljø også modifisere biologien til andre populasjoner av stamcelle-nisjen inkludert osteoblaster, endotelceller eller makrofager. For å undersøke alternative celler som MIF kan ha en innvirkning på, vil det bli testet effektene på disse populasjonene. MSC-er vil bli indusert til å differensiere til osteoblaster, adipocytter eller kondrocytter. MIF vil deretter bli lagt til for å undersøke spredning, cellesyklus og migrasjon av populasjoner av interesse. Effekt på osteoblaster og endotelceller vil bli modellert ved hjelp av henholdsvis MG63 og Huvec cellelinjer.

1.9. Studiepopulasjon 1.9.1. Deltakerrekruttering 300 voksne pasienter (>18) nydiagnostisert med AML vil bli inkludert i studien. 85 pasienter diagnostisert siden november 2015 ved Saint-Antoine Hospital vil bli retrospektivt inkludert i studien. 215 pasienter som nylig er diagnostisert med AML ved Saint-Antoine og Tours universitetssykehus vil bli prospektivt inkludert [>100 AML pasienter per år henvises til Saint-Antoine sykehus (>70 pasienter per år) og Tours University Hospital for AML (>30 pasienter pr. år)].

1.9.2. Deltakeroppfølging

Innsamling av pasientprøver:

Bare standard blod- og benmargsprøver vil bli brukt i studien:

• Blodprøver for biokjemi, blodcelletall, immunfenotyping, cytogenetikk, molekylærbiologiske analyser og kryokonservering av tumorbanker
• Benmargsprøver for immunfenotyping, cytogenetikk, molekylærbiologiske analyser og kryokonservering av tumorbanker

Tidspunkter:

Kun prøver av standard pleietidspunkt vil bli samlet inn:

• Diagnosetidspunkt (dag 0, Dx-prøve)
• Etter den første kuren med kjemoterapi (tidspunkt C1)
• Etter den andre kuren med kjemoterapi (tidspunkt C2)
• Etter den tredje kuren med kjemoterapi (tidspunkt C3)

• Ved tilbakefall eller ildfasthet,

  • på tidspunktet for diagnosen første tilbakefall eller refraktæritet (RR1)
  • på tidspunktet for diagnose av andre tilbakefall eller refraktæritet (RR2)
• Langsiktige remisjonskontrollprøver 1, 2, 3 år etter diagnose (LTR1, 2, 3)